[发明专利]荧光强度校正方法、荧光强度计算方法及计算装置

说明书

技术领域

本发明涉及荧光强度校正方法、荧光强度计算方法、以及荧光强度计算装置。更具体地，本发明涉及一种荧光强度校正方法、一种荧光强度计算方法、以及一种荧光强度计算装置(calculating apparatus)，其各自分别能够精确地计算由多个(多种，plural)荧光染料产生的荧光的强度，其中微粒(微小粒子，microparticle)用该多个荧光染料进行多重标记。

背景技术

迄今为止，已使用仪器(如流式细胞仪)来标记微粒，如用荧光染料(荧光色素，fluorescent dye)来标记细胞，并测量由通过对微利照射激光束而激发的荧光染料产生的荧光的强度或模式，由此测量该微粒的特性。近年来，已进行了多色测量(multicolor measurement)以更加精细地分析细胞等的特性。在这种情况下，多色测量是这样的测量，其中微粒用多个荧光染料标记，并且通过使用分别对应于不同的接收光波长带的多个光检测器(如PMT)来测量由各个荧光染料产生的光。在多色测量中，选择和使用荧光波长与各个光检测器的接收光波长带一致的荧光染料。

在另一方面，荧光染料(如FITC、藻红蛋白(PE)以及别藻蓝蛋白(APC))的荧光中心波长彼此靠近。因而，存在其中荧光光谱彼此重叠的波长带。因此，在基于这些荧光染料的组合进行多色测量的情况下，即使当通过利用滤光器将由各个荧光染料产生的荧光彼此通过波长带分开时，由不同于目标荧光染料的荧光染料产生的荧光在某些情况下仍然会泄漏到光检测器。当发生荧光的泄漏时，通过各个光检测器测得的荧光强度变得大于由目标荧光染料产生的荧光的真实强度，因而发生数据上的错配。

为了校正数据上的错配，进行了荧光校正(补偿)：从通过光检测器测得的荧光强度减去泄漏的荧光强度。荧光校正是使得将电或数学校正加入专用回路上的脉冲，以使通过光检测器测得的荧光强度变成由目标荧光染料产生的荧光的真实强度。

一种以向量形式表示通过各个光检测器测得的荧光强度，并使之前设置的泄漏矩阵(leakage matrix)的逆矩阵(inversion matrix)作用于该向量，从而计算由目标荧光染料产生的荧光的真实强度的方法称作算术地进行荧光校正的方法。在日本专利临时公开No.2003-83894中描述了这种方法(参照图10和11)。通过分析用荧光染料单个标记(single-labeled)的微粒的荧光波长分布而产生泄漏矩阵，并且以列向量的形式排列荧光染料的荧光波长分布。另外，泄漏矩阵的逆矩阵也称作“校正矩阵(correction matrix)”。

发明内容

由于在利用校正矩阵的荧光强度校正方法下，使得泄漏矩阵的逆矩阵作用于具有通过各个光检测器测得的荧光强度作为其要素的向量，所以必要的是，泄漏矩阵是方矩阵。

泄漏矩阵的矩阵大小取决于使用的荧光染料的数量和使用的光检测器的数量。因此，为了使校正矩阵可以是方矩阵，必要的是，使用的荧光染料的数量和使用的光检测器的数量彼此相等。图10A至10C以及图11例举了通过利用5种荧光染料(FITC、PE、ECD、PC5、以及PC7)和5个光检测器进行五色测量的情形。

最近，为了满足用户的需要：期望增加可用的荧光染料的数量以精细地分析细胞等的特性，也已开发了其中增加光检测器的数量的装置。在这样的设置有大量光检测器的装置中，测量中使用的光检测器的数量在某些情况下可能大于标记微粒所使用的荧光染料的数量。在这样的情况下，为了有效地应用利用校正矩阵的荧光校正，必要的是，使用的荧光染料的数量和使用的光检测器的数量彼此相等。因此，通过适当选择光检测器(其数量与荧光染料的数量一致)来利用测量数据，而没有利用从所有光检测器获得的测量数据(measured data)。为此，引起以下问题：没有有效地利用所获得的测量数据。

为了解决上述问题，形成了本发明，并因此期望提供一种荧光强度校正方法、一种荧光强度计算方法、以及一种荧光强度计算装置，在通过多个光检测器对标记有多个荧光染料的微粒进行多色测量的情况下，它们各自能够有效地利用从所有光检测器获得的测量数据而不取决(依赖)于荧光染料的数量，从而精确地计算由各个荧光染料产生的荧光强度。