[发明专利]一种利用基因工程菌生产L-鸟氨酸盐酸盐的方法

权利要求书

1.一种利用大肠杆菌TOP10/PBAD/Thio-TOPO-Arg-Bsub基因工程菌生产L-鸟氨酸盐酸盐的方法，

该大肠杆菌基因工程菌保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，中国武汉武汉大学，保藏编号CCTCC No.M2010358；

生产方法包括如下步骤：

(1)、将低温保存的大肠杆菌E.coli TOP10/pBAD/Thio-TOPO-arg-Bsub基因工程菌株在含有100μg/ml Amp的平板上划线，37℃倒置培养，得到单菌落；

(2).将Amp平板上长出的单菌落接种到含有100μg/ml的Amp的3.5ml LB培养基的试管中，37℃、225r/min，振荡培养过夜，12～16小时，得到一级种液。

(3).取培养好的一级种液9ml接种到装有100ml 2％的玉米浆培养基的摇瓶中，37℃、225r/min，振荡培养8小时，OD＝3，得到二级种液。；

(4).取培养好的二级种液1.2L接种到30L 4％的玉米浆培养基中，发酵温度控制在37℃，培养过程中补加600ml灭菌甘油，整个发酵过程中，用浓氨水调pH7.0～8.0，调整搅拌速度和空气流量，使溶氧量不低于20％，当细菌生长至OD₆₀₀＝6.0，12小时，降温至30℃，并加入3g L-Ara进行诱导，诱导8小时停止发酵培养，收集湿菌体；

(5).将发酵好的菌液在4℃，5000r/min，离心10min，弃上清，收集菌体；

(6).按菌∶精氨酸＝0.6∶10的比例，向100升pH9.0的15％的精氨酸底物溶液中加入湿菌体900克，把溶液中Mn²⁺浓度调整为10μmol/L，温度38℃酶解转化。转化18小时后，点薄板检测精氨酸酶解情况，精氨酸转化率≥98％时，进入下一工序；

其中薄层层析所用的展层剂配比为：

正丁醇∶丙酮∶浓氨水∶水＝10∶10∶5∶2。

(7).用6M盐酸将酶解液pH调到5.0左右，60℃，保温30min；按底物量的15％加入活性炭，60℃，脱色30min后，过滤至清亮；

(8).滤液在0.08Mpa以上的真空下浓缩至底物量的2.5～3倍体积；

(9)再按底物量的8％加活性炭，60℃，脱色30min后，过滤至清亮；

(10)继续减压浓缩至底物量的1.5倍的体积，加入一倍体积的95％的乙醇，冷却后，第一批L-鸟氨酸盐酸盐结晶析出。用第一次结晶产物湿重的一半数量体积的85％的乙醇洗涤结晶产物两次并甩干，烘干得产品，洗涤液和母液合并用于进一步回收L-鸟氨酸盐酸盐产品。

2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于：所述的1)步骤中的平板培养基配制方法如下：

LB培养基的配制：

称取10g蛋白胨、5g酵母粉与10gNaCL溶于950ml的水中，调pH至7.0后，加水定容到1000ml，分装成100ml份三角瓶；

100μg/mlAmp平板的配制：

称取1.5g琼脂粉溶于含100mlLB的三角瓶中，盖上瓶塞，121℃灭菌20min。待温度降至45℃以下时，加入5％的Amp储存液200μl，混匀后立即无菌分装到已灭好菌的玻璃平板中，待溶液凝固后，置于4℃的冰箱中保存备用。

3.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于：所述的2)步骤中的含有100μg/ml的Amp试管培养用LB培养基配制方法如下：

含有100μg/ml的Amp的试管培养用LB培养基的配制：

取三角瓶装的100mlLB培养基一瓶，盖上瓶塞，121℃灭菌20min。待温度降至40℃以下时，加入5％的Amp储存液200μl，混匀后立即无菌分装到已灭好菌的玻璃试管3.5ml份备用。

4.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于：所述的3)步骤中的摇瓶培养用2％玉米浆培养基配制方法如下：

2％玉米浆培养基的配制；

玉米粉20g/L、味精15g/L、磷酸氢二钾10g/L、硫酸镁10g/L，加水定容到1000ml，PH7.0；分装成100ml份三角瓶，盖上瓶盖，121℃灭菌20min，备用。