[发明专利]D-氨甲酰水解酶的突变体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体内容涉及D-氨甲酰水解酶的突变体及其制备方法和应用。

背景技术

β-内酰胺类抗生素具有抗菌活力强，广谱低毒等优点，是临床控制细菌感染的首选药物之一。D-对羟基苯甘氨酸(DHPG)是合成该类药物的一种重要中间体，用于制备羟氨苄青霉素和羟氨苄头孢菌素的侧链。D-对羟基苯甘氨酸的制备在工业上有化学合成法和酶法两种方法，其中化学合成法成本高，污染大；而酶法具有成本较低、无污染的特点，因此日益受到重视。酶法的技术原理是：D-乙内酰脲酶(也称为D-海因酶)将DL-对羟基苯海因不对称水解为N-氨甲酰基-D-对羟基苯甘氨酸，然后在N-氨甲酰-D-氨基酸水解酶(也称为D-氨甲酰水解酶，简称DCase)的作用下，将N-氨甲酰基-D-对羟基苯甘氨酸不可逆水解转变成DHPG。

工业生产中发现：在两步酶法生产D-对羟基苯甘氨酸的过程中，由于DCase催化效率低、稳定性差的缺点，导致中间物N-氨甲酰基-D-对羟基苯甘氨酸大量积累，终产物D-对羟基苯甘氨酸产率低。因此DCase成为两步酶法反应系统中的一个关键酶、限速酶。

随着基因工程技术的发展，大肠杆菌表达系统的日臻成熟，将DCase基因在大肠杆菌表达系统中进行过量表达，从而获得高表达、高活力的基因工程菌株成为可能。例如，许祯等从一株能将DL-对羟基苯海因转化为D-对羟基苯甘氨酸的菌株中，成功克隆出DCase基因，Genbank索取号为：AF320814(许祯等，生物工程学报，2002，18(2)：149-54)。本发明人的实验室在将DCase基因构建入pET表达系统，转化E.coli过量表达后，对目的蛋白的活性和表达情况进行分析，结果显示：E.coli可以大量表达出重组蛋白，但是70-80％左右的重组蛋白是以包涵体的形式存在，严重影响了该酶的功能发挥。如何使更多的目的蛋白表达后能够正确折叠成为有活力的蛋白成为研究和努力的方向。前期对DCase的研究表明，其18位和30位残基的疏水性对目的蛋白的可溶性有较大影响，分别将这两个位点突变为疏水性不同的氨基酸(A18Y、A18N、A18D、A18E；Y30E、Y30D)，可溶性有进一步提高。

虽然天然酶分子在自然条件下已经进化了千百万年，但是因为天然酶分子存在的环境与实际应用的环境不同，酶分子仍然蕴藏着巨大的进化潜力。运用定点突变技术等对微生物来源的酶进行分子改造和人工进化在近些年中取得了令人瞩目的进展(参见：王正祥等，生物工程学报，16(3)，2000)，已经成为酶的人工工程改造的常用手段。这种分子水平上的改造技术是通过体外定点突变来改造靶基因，从而创造具有新功能的改性的酶，大大加速了蛋白质的进化进程。

因此，本领域有必要进一步改进天然的酶分子，以期更大限度地提高酶的表达以及酶活力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种D-氨甲酰水解酶的突变体及其制备方法和应用。

在本发明的第一方面，提供一种突变型D-氨甲酰水解酶，其对应于SEQ ID NO：2氨基酸序列的第18位由丙氨酸(A)突变为谷氨酸(E)，第30位酪氨酸(Y)突变为天冬氨酸(D)，第34位赖氨酸(K)突变为谷氨酸(E)。

在另一优选例中，所述的突变型D-氨甲酰水解酶是：

(a)具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的蛋白；或

(b)由(a)所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个(如1-20个；较佳地1-10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸且保留(a)蛋白活性的由(a)衍生的蛋白；且该蛋白的氨基酸序列中对应于SEQ ID NO：3第18位上的氨基酸为谷氨酸，对应于SEQ ID NO：3第30位上的氨基酸为天冬氨酸，对应于SEQ ID NO：3第34位上的氨基酸为谷氨酸。

在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，该多核苷酸选自下组：

(i)编码所述的突变型D-氨甲酰水解酶的多核苷酸；或

(ii)与(i)中的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的突变型D-氨甲酰水解酶。

在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或基因组中整合有所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的宿主细胞是原核细胞；在另一优选例中，所述的宿主细胞是大肠杆菌。