[发明专利]一种家蚕肠道益生菌的分离鉴定及其酶基因的克隆与表达

说明书

技术领域

本发明涉及一种家蚕肠道益生菌的分离鉴定及其酶基因的克隆与表达方法，属生物技术领域。

背景技术

动物肠道是多种微生物生长繁殖的理想场所。正常肠道微生物对宿主具有营养、免疫、生长刺激、生物拮抗等作用，是机体的生理组成部分。蚕是有着巨大经济效益和社会效益的重要经济昆虫。但是蚕业生产过程中一直存在着叶丝转化率低(10％左右)，桑叶成本占蚕茧生产成本的50％以上。同时，蚕病发生率高，我国每年因蚕病损失的茧量达10％以上。因此，通过多种渠道提高蚕对桑叶的利用率，提高叶丝转化率，减少蚕病的发生，是蚕业生产上长期面临的重要课题。微生态制剂的应用与发展为解决这些问题提供了良好的途径。在动物疾病的防治中，抗生素应用弊端日益显现，微生态制剂具有促动物生长、防治疾病，无副作用等特点，也因此成为抗生素理想的替代品之一。

家蚕作为一种重要的经济动物与鳞翅目昆虫研究模型，具有生长快、周期短的特点。在幼虫期20多天时，家蚕除了本身具有消化食物的能力之外，肠道中种类繁多、数量巨大的微生物群体也对其食物的消化和营养的吸收起重要作用。同时，由于长期驯化的结果，家蚕防病能力极其脆弱；肠道内有益菌群的存在，能够有效地帮助家蚕抵制内源性细菌病害的侵袭。因此，肠道里的微生物对家蚕具有重要意义，将产酶益生菌添加到家蚕人工饲料中或涂抹于桑叶表面喂食家蚕，将有利于蚕充分消化吸收营养物质，提高饲料效率。

家蚕的中肠是消化桑叶的主要场所，聚集着大量各种各样的微生物，这些微生物在家蚕饲料消化、疾病发生等方面起着重要作用，因而它们是作为家蚕微生态制剂的很好材料。肠道益生菌可通过其所分泌的酶起到益生作用。研究蚕肠道菌及其产酶并对产酶基因进行原核表达分析，在改善蚕肠微生态环境及蚕人工饲料开发上有一定意义。

目前国内关于家蚕肠道益生菌的研究主要集中于其抗病与助消化方面，尚处于起始阶段。易发平等对不同蚕期、不同龄期间肠道好氧微生物种群构成及其变化进行了系统的研究(西南农业大学学报，2001，23(2)：117-119)，但没有对益生菌群进行研究。高绘菊等对家蚕肠道产蛋白酶菌株进行了分离与筛选(家蚕肠道产酶菌的分离与筛选，蚕业科学，2007，33(2)：228～233.)，从家蚕肠道中分离得到30株菌株，研究了它们的胞外淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶和脂肪酶的产酶能力，家蚕肠道中的各种产酶菌高达60％，表明了肠道菌在家蚕食物消化过程中的重要性，但未对产酶微生物作出鉴定。孙雪奇等从家蚕肠道内筛选出多株好氧及兼性厌氧微生物(家蚕肠道好氧和部分兼性厌氧微生物及蚕用微生态制剂的研究[J].四川蚕业，1996，24(1)：13-15.)，选用其中5个属的5株菌，加上另一种菌配成4种混合菌液，在家蚕4龄最后一天进行添食试验，其结果是发病率明显降低，全茧量和茧层量也有较大提高。其它关于家蚕基因和人类互作效应方面的研究较多。目前尚未见关于家蚕肠道产酶益生菌的定向选育与作用机理研究的报道。

目前关于α-淀粉酶的研究，主要集中在分子改良及工业生产应用方面。包括对该酶基因的启动子功能、编码区序列的克隆及在不同表达体系中进行原核及真核表达等，以及对其基因突变、基因表达调控、将基因转入植物中的表达研究和基因功能的机理研究，如耐热性的作用机制，极端环境下其酶学性质等，对含该基因的重组质粒在传代过程中的保持率等问题也引起了较多关注。工业生产应用方面也有较多的研究报导。目前，暂未见肠源性蜡样芽孢杆菌及其所产酶类在蚕业微生态制剂方面的应用，且关于肠源性α-淀粉酶产生菌的研究报导也不多。

发明内容

本发明的目的在于提供一种家蚕肠道益生菌的分离鉴定及其酶基因的克隆与表达方法，对家蚕肠道中蜡样芽孢杆菌进行分离鉴定及酶基因的克隆与表达，对改善家蚕肠道环境，提高桑叶、饲料淀粉消化率及叶丝转化率有着重要的意义。

本发明的目的在于提供一种家蚕肠道益生菌酶，它是肠道微生物源α-淀粉酶，具有SEQID NO 3所述的氨基酸序列。

本发明的目的还在于：

提供一种家蚕肠道益生菌酶的基因，具有SEQ NO ID 1或SEQ NO ID 2所述碱基序列。

提供一种含上述基因的表达载体及由表达载体转化的宿主细胞。

本发明的另一目的在于：提供一种家蚕肠道益生菌酶菌株的分离方法，包括以下步骤：

1)随机取家蚕大造品种五龄幼虫，饥饿24h后待用；