[发明专利]通过超量表达comA基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法

权利要求书

1.通过超量表达comA基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法，其特征在于：

（1）comA基因整合载体pDK-ComA的构建

设计引物EM-F和EM-R，以pMUTIN4质粒DNA为模板PCR扩增红霉素抗性基因EM，获得850 bp基因片段；设计引物ComA-F和ComA-R，以枯草芽孢杆菌ATCC 9943基因组DNA为模板PCR扩增comA基因，获得645 bp基因片段；扩增得到的两个基因分别克隆至pMD19-T载体，转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH5a，经验证、测序正确后，分别命名为pEM-T、pComA-T，于-20℃条件下保存备用；

名称序列酶切位点ComA-F5’CCGGAATTCATGACCAGTCAGTCAATAAAAAATG3’EcoRIComA-R5’GCGGGATCCTTACTCTTCTTCCGTTCCCGG3’BamHIEM-F5’CGATACGTATGATAGGTGGTATGTTTTCGC3’SnaBIEM-R5’AAAAGTACTCATGTGTACATTCCTCTCTT3’SacI

pDK用snaBI/SalI双酶切后获得的大片段，与经过相同双酶切处理的pMUTIN4载体后获得的包括Pspac启动子和多克隆位点MCS的片段，用T₄  DNA连接酶连接，构建pDK-Pspac载体，酶切验证正确后于-20℃条件下保存备用；

pDK-Pspac用SnaBI/sacI双酶切后获得的大片段，与经过相同双酶切处理的pEM-T载体后获得的EM基因片段，用T₄ DNA连接酶连接，构建pDK-Pspac-EM载体，酶切验证正确后于-20℃条件下保存备用；

pComA-T用BamHI/EcoRI酶切后获得comA片段，与经过相同酶切处理的pDK-Pspac-EM载体，用T₄ DNA连接酶连接，构建comA基因超量表达载体pDK-ComA，酶切验证正确后，转化大肠杆菌DH5a，用于下一步转化；

（2）FMB 27突变菌株的构建

以枯草芽孢杆菌ATCC 9943制备感受态细胞，采用电转化方法，将获得的comA基因超量表达载体pDK-ComA转化入枯草芽孢杆菌ATCC 9943，在基因组amyE位点发生双交换，红霉素平板上筛选得到红霉素抗性菌株，命名为FMB 27；该菌株的amyE基因被Pspac-ComA基因所取代，成为超量表达comA基因的突变菌株，即为所得到的菌株。