[发明专利]通过超量表达comA基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及通过超量表达comA基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法，属于生物技术领域。

二、背景技术

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是目前公认的安全微生物之一，其抗菌代谢产物丰富多样，尤其是脂肽类抗菌物质，不仅抗菌谱广而且还具有生物表面活性剂的功能，因此不仅可以在农业上用于进行生物防治，而且在工业和环境保护上也有着广泛的应用。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ATCC 9943是一种可以分泌 surfactin，fengycin等抗菌肽物质的枯草芽孢杆菌（Valérie Leclère, Romain Marti, Max Béchet.  The lipopeptides mycosubtilin and surfactin enhance spreading of Bacillus subtilis strains by their

目前，世界范围内，提高其产量的方法主要是筛选优良菌株，以及优化发酵条件，而很少采用分子生物学技术对菌种进行改良的方法来提高其产抗菌物质的产量。但随着对抗菌肽合成分泌研究的日益深入，已经逐渐开始采用分子生物学技术，通过改造其合成分泌中信号通路等方法来对原始菌种进行基因改良，从而提高其自身合成分泌抗菌肽能力。

comA基因（Gene ID: 126362990），其表达产物枯草杆菌感受态因子ComA是枯草杆菌中十分重要的调控蛋白之一，在枯草芽孢杆菌各种生理代谢过程中发挥着重要的作用，相关研究表明，ComA蛋白可以与surfactin合成酶基因启动子结合从而刺激其表达。

本方法首先以枯草芽孢杆菌ATCC 9943为出发菌株，以枯草杆菌整合载体pDK为骨架构建一个基因整合载体pDK-ComA，利用同源重组原理，通过双交换过程将comA基因整合到枯草芽孢杆菌ATCC 9943基因组中使其超量表达的方法构建了一个高产抗菌肽菌株FMB 27。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的是利用分子生物学技术，构建comA超量表达载体，经过电转化通过同源重组将Pspac-comA基因整合入枯草芽孢杆菌ATCC 9943基因组amyE位点，从而构建一种高产抗菌肽的枯草芽孢杆菌菌株FMB 27。

技术方案

1、通过超量表达comA基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法，其特征在于：

（1）comA基因超量表达载体pDK-ComA的构建

根据红霉素抗性基因设计引物EM-F和EM-R，以pMUTIN4质粒DNA为模板PCR扩增红霉素抗性基因，获得850 bp基因片段；根据枯草芽孢杆菌comA基因设计引物ComA-F和ComA-R，以枯草芽孢杆菌ATCC 9943基因组DNA为模板PCR扩增comA基因，获得645 bp基因片段；扩增得到的两个基因分别克隆至pMD19-T载体，转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH5a，经验证、测序正确后，分别命名为pEM-T、pComA-T，于-20℃条件下保存备用；