[发明专利]针对c-Met基因RNA干扰的重组腺病毒

权利要求书

1.一种针对c-Met基因RNA干扰的重组腺病毒，其特征在于它含有人c-Met基因siRNA的表达序列，所述表达序列为：正义链为序列表中的SEQ ID No：1，反义链为序列表中的SEQ ID No：2的双链RNA序列。

2.根据权利要求1所述的重组腺病毒，其特征在于所述c-Met基因siRNA的特异性靶序列编号为NM_000245的人c-Met基因cDNA编码序列中242-260共19nt的特异性siRNA靶序列。

3.根据权利要求1或2任一项所述的重组腺病毒，其特征在于构建所述重组腺病毒所用的穿梭质粒为pSES-siRNA-c-Met。

4.根据权利要求3所述的重组腺病毒，其特征在于构建所述重组腺病毒所用的重组体质粒为pAd-siRNA-c-Met。

5.根据权利要求4所述的重组腺病毒，其特征在于构建所述重组腺病毒所用的包装细胞为HEK293细胞。

6.一种权利要求1所述的重组腺病毒的构建方法，包括以下步骤：

（1）、以基因编号为NM_000245的人c-Met基因cDNA编码序列，根据siRNA靶序列遴选设计原则，经BLAST序列同源性分析后，选取人c-Met基因cDNA编码序列中242-260共19nt的特异性siRNA靶序列，设计人c-Met基因siRNA的表达序列： 正义链为序列表中的SEQ ID No：1，反义链为序列表中的SEQ ID No：2的双链RNA序列； 在上述序列的两端分别引入酶切位点粘端，化学合成带有酶切位点粘端的单链DNA片段及其互补单链DNA片段，将上述互补单链退火得到的退火产物即人c-Met基因siRNA的双链表达模板；

（2）、腺病毒穿梭质粒pSES-siRNA-c-Met的构建：用Sfi I酶切pSES-HUS质粒，乙醇沉淀， 将回收的载体片段和目的基因片段即人c-Met基因siRNA的双链表达模板在16℃连接过夜，转化DH10B菌，卡那霉素选择性培养基筛选阳性克隆，提取质粒，以Wizard?? Plus抽提质粒； 

（3）、重组体质粒pAd-siRNA-c-Met的构建：将BJ5183 AdEasy菌制备成感受态备用，取pSES-HUS-siRNA-c-Met 干扰序列质粒，经Pme I 酶切线性化，取20ul电转化BJ5183 AdEasy感受态细菌，卡那霉素抗性筛选，挑取10个较小的菌落，在卡那霉素LB培养基中培养过夜，得到的重组腺病毒质粒命名为pAd-siRNA-c-Met，将其转化至ER2566感受态细菌，Wizard Plus抽提质粒备用；

（4）、重组腺病毒制备：取pAd-siRNA-c-Met重组体10ul，经PacI酶切线性化电泳鉴定正确后，取细胞密度约为60%-70%的HEK293细胞，用无血清DMEM洗两遍备用，向含500uL无血清DMEM培养基中加入15ul lipofastamine和pAd-siRNA-c-Met，室温静置15min；将混合物加入HEK293细胞中，培养5-6小时，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养，每日观察细胞形态和红色荧光表达，待两周左右，大部分细胞出现荧光时，用吸管轻轻吹打细胞至大部分悬浮，收集细胞，于-80℃和37℃反复冻融三四次，离心收集病毒上清，为病毒原液，保存于-80℃；

（5）、重组腺病毒的大量扩增：取部分首次包装病毒原液再次感染HEK293细胞，三四天后收集细胞，反复冻融细胞，离心收集病毒上清，按此法2次扩增病毒最终获得高滴度腺病毒。