[发明专利]针对c-Met基因RNA干扰的重组腺病毒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学与生物医药技术领域，特别是涉及一种针对c-Met基因RNA干扰的重组腺病毒。

背景技术

C-Met 是在细胞的生长和发育中一个关键基因，也是HGF（肝细胞生长因子）的特异性受体，在体内多种组织中分布广泛，包括上皮组织，内皮细胞、肝实质细胞、造血、免疫及网状内皮系统。深入其研究的意义在于HGF/c-Met信号传导不仅对肝细胞再生有十分重要的作用, 对其他多种细胞也起着促有丝分裂、细胞运动、组织器官的形态发生、管腔形成、刺激T细胞粘附和游走、延长神经原寿命及调节红细胞系分化等多种作用，因此HGF/c-Met在器官发育、组织细胞的生长和分化、肿瘤的生长和侵袭中的作用和意义的研究成为近年来相关研究的热点。

腺病毒介导的RNA干扰是一项新技术，抑制或阻断基因表达的技术主要有三种：反义寡核苷酸、核酶和RNA干扰技术。其中，反义寡核苷酸、核酶技术存在效率低、特异性差，不稳定等缺点。RNA干扰即RNAi是利用双链RNA高效、特异的阻断体内特定基因表达，促使mRNA降解，使细胞表现出特定基因缺失表型的过程。

RNA干扰技术(RNA interference，简称RNAi)是通过小分子双链RNA(ds RNA) 特异性互补靶向基因转录本，从而诱导转录后基因沉默的一种方式。将双链RNA降解成长度为21-23nt的小干扰RNA片段(siRNA，small interfering RNA)，这些小片段会进一步介导与其同源的单链RNA降解，其结构稳定，无须像反义核苷酸那样进行广泛的化学修饰以提高其半衰期，并能在低于反义核苷酸几个数量级的浓度下，使靶基因降低至极低水平甚至完全“敲除”，从而产生缺失突变表型。siRNA的干预效应关键取决于其靶基因序列的选择，任一nt的错误均会导致RNAi效应的丧失，这种高度序列特异性使其对点突变、序列插入和缺失的选择性基因静寂具有重要的药理作用。已证实，RNA干扰技术可单独或与其它现有的治疗手段一同用于突变所致的疾病，还可以用于治疗肿瘤。 

发明内容

本发明的目的是提供一种针对c-Met基因RNA干扰的重组腺病毒，它含有人c-Met基因siRNA的表达序列，所述表达序列为：正义链为序列表中的SEQ ID No：1，反义链为序列表中的SEQ ID No：2的双链RNA序列。

所述c-Met基因siRNA的特异性靶序列编号为NM_000245的人c-Met基因cDNA编码序列中242-260共19nt的特异性siRNA靶序列。

所述重组腺病毒所用的穿梭质粒为pSES-siRNA-c-Met。

所述重组腺病毒所用的重组体质粒为pAd-siRNA-c-Met。

所述重组腺病毒所用的包装细胞为HEK293细胞。

该腺病毒转染人外泌汗腺上皮细胞后，能抑制细胞中c-Met蛋白表达70%以上，适合实验室推广应用；一是技术稳定，重复性好；二是采用AdEasy系统构建了含siRNA-c-Met的腺病毒，利用抗生素筛选重组子，简化了筛选工作；三是经重组的腺病毒带有RFP基因，可直接通过荧光显微镜检测病毒；四是获得的腺病毒转染效率高。

本发明的另一目的是提供一种针对c-Met基因RNA干扰的重组腺病毒的构建方法，包括以下步骤：

（1）、以基因编号为NM_000245的人c-Met基因cDNA编码序列，根据siRNA靶序列遴选设计原则，经BLAST序列同源性分析后，选取人c-Met基因cDNA编码序列中242-260共19nt的特异性siRNA靶序列，设计人c-Met基因siRNA的表达序列：正义链为序列表中的SEQ ID No：1，反义链为序列表中的SEQ ID No：2的双链RNA序列； 在上述序列的两端分别引入酶切位点粘端，化学合成带有酶切位点粘端的单链DNA片段及其互补单链DNA片段，将上述互补单链退火得到产物即人c-Met基因siRNA的双链表达模板；

（2）、腺病毒穿梭质粒pSES-siRNA-c-Met的构建：用Sfi I酶切pSES-HUS质粒，乙醇沉淀， 将目的基因片段和回收的载体片段（人c-Met基因siRNA的双链表达模板）16℃连接过夜，转化DH10B菌，卡那霉素选择性培养基筛选阳性克隆，提取质粒，PCR鉴定siRNA c-Met是否已连接载体 pSES-HUS成功，再用KpnⅠ，EcoRⅤ双酶切鉴定正确后，以Wizard?? Plus抽提质粒，基因测序中心测序，正确克隆命名为pSES-HUS-siRNA c-Met；