[发明专利]抗破伤风毒素单克隆中和抗体，其组合物及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物免疫学领域。更具体地说，本发明涉及特异性中和破伤风毒素的抗破伤风毒素单克隆抗体，其组合物及其医药用途。

背景技术

破伤风(Tetanus)是一种人畜共患的严重感染疾病，由破伤风梭状芽胞杆菌(Clostridium tetani)感染引起。在厌氧条件下细菌于创口生长繁殖，产生大量的毒素，毒素侵害中枢神经系统，导致患者全身性肌肉强直性痉挛，形成破伤风特有的牙关禁闭、角弓反张等症状，严重者最后会死于窒息及全身性衰竭。目前，在大部分发展中国家破伤风仍然是一个主要的公共卫生问题，每年大约有100万人死于破伤风，其中新生儿占死亡总数80％。

破伤风梭状芽胞杆菌，长4～8μm，宽0.3～0.8μm，经常以相当长的细丝形式存在，形成芽胞时，细菌呈特殊的鼓槌状，芽胞为卵圆形。破伤风梭状芽胞杆菌为严格厌氧菌，其芽胞可抗高温抗干燥，对大多数防腐剂由抗性，但对碘的水溶液及中性戊二醛溶液敏感，可在短时间内被这些试剂杀灭。破伤风梭菌可以产生两种外毒素：一种是具有溶血作用的破伤风溶血毒素；另一种是破伤风痉挛毒素，即常说的破伤风毒素。

破伤风毒素是由破伤风梭状杆菌产生并分泌至菌体外的一种蛋白质，由1315个氨基酸组成，相对分子质量为150700Da。破伤风毒素的基因存在于一个75Kb的质粒上，编码基因长约4Kb。破伤风毒素在菌体内表达后是单一的一条蛋白质链，在分泌过程中被蛋白酶裂解成由二硫键链接的轻链和重链。根据毒素在体内的作用，破伤风毒素分子分为A、B、C三个部分，毒素的轻链片段为A片段，重链N末端的一半为B片段，另一半为C片段。

破伤风毒素是已知最毒的毒素之一，经纯化的破伤风毒素对小鼠的致死剂量为0.1ng/kg，对豚鼠的致死剂量为0.3ng/kg，推测对人的致死剂量为0.25ng/kg。它的作用过程一般为结合、导入和作用三步。研究结果表明毒素的C片段可以和毒素的受体结合，毒素的受体一般认为是神经节苷脂，毒素的C片段具有逆行轴突运输进入中枢神经系统的功能，已被用于研究亚单位疫苗；B片段可以在人工磷脂膜上形成离子通道，将毒素的活性片段导入到细胞内；毒素的A片段分子是Zn蛋白酶，具有蛋白酶活性，它可以裂解神经细胞膜上的传送神经递质的蛋白质-囊泡相关膜蛋白，从而抑制神经递质的释放，使兴奋的冲动不停传递，导致患者产生强直性痉挛的临床症状。然而，从破伤风毒素中直接提取和纯化C片段亦有许多弊端：破伤风毒素毒性高，易形成芽胞进行传播，培养、分离过程复杂、回收率不高，且具有一定危险性。

破伤风类毒素疫苗作为主动免疫疗法被应用于破伤风的预防。破伤风类毒素是用破伤风梭状芽胞杆菌菌种在适宜的培养基中培养产生的毒素，经甲醛脱毒、精制并加入氢氧化铝佐剂后制成的疫苗。类毒素接种过程中虽然消除了培养基成分或多次加强注射等引起的过敏因素，还是有一定的不良反应发生(如类毒素疫苗制品纯度不高、致敏性强等)，临床上较难推广。而且类毒素疫苗在我国是作为计划免疫接种的，用量很大，其质量尤为重要，这极大限制了类毒素疫苗的应用。

破伤风毒素毒性极强，作用迅速，因此破伤风的有效预防和治疗往往需要及时注射破伤风抗毒素(Tetanus antitoxin，TAT)或破伤风人血免疫球蛋白(Human tetanus immunoglulin，HTIG)。

破伤风抗毒素是用破伤风梭状杆菌或类毒素免疫动物获取而制备的免疫血清，该血清具有中和的破伤风毒素的能力。目前我国用于临床的破伤风抗毒素主要为马血清。抗毒素和毒素的中和反应只能在毒素处于游离的状态下才能发生，而且用抗毒素预防或治疗破伤风其成败的关键在于时间。若抗毒素能赶在毒素与易感细胞或组织结合之前中和毒素，其治疗效果是肯定的。然而，另一方面，破伤风毒素抗作为异种蛋白的抗原性毕竟还未完全改变，血清过敏反应的危险性仍未彻底根除。尤其是我国有大量人群已使用过破伤风抗毒素，再次使用的可能性较大，因此产生血清过敏的风险也更大，临床应用受到一定的限制。关键的是，抗毒素的临床应用效果不确实，马血清抗毒素在体内的半衰期短，不利于预防作用。

破伤风人血免疫球蛋白是采集经破伤风类毒素免疫的健康献血者抗体滴度较高的抗毒素血浆制备而成的抗体，属人源性同种蛋白，较为安全，几乎不会发生血清病与过敏反应。而且，该免疫球蛋白半衰期长，可达3～4周，大大提升了破伤风的防治水平。但由于人血来源困难，价格昂贵，工业化生产复杂，易受病毒污染，使破伤风人血免疫球蛋白的应用受到了极大地限制。因此，目前主要还是由马血清破伤风抗毒素占领着市场。