[发明专利]酿酒酵母展示亚油酸异构酶催化合成共轭亚油酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种酿酒酵母展示亚油酸异构酶催化合成共轭亚油酸的方法。

背景技术

共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid，以下简称CLA)是含有顺式或反式共轭双键的十八碳二烯酸，是必需脂肪酸亚油酸(Linoleic acid，以下简称LA)衍生而成的一组位置和构象异构体的总称。许多微生物能利用自身的亚油酸异构酶将亚油酸转化成共轭亚油酸。但目前应用的亚油酸异构酶主要存在以下问题：酶的重组表达方式一般是细胞内表达和分泌表达，细胞内表达时由于酶不能与细胞外底物接触，从而极大地影响酶的催化效率，而且酶分子集聚在细胞内形成反馈抑制，也影响表达效率；分泌表达的主要缺点是表达效率不高，而且也不能实现完全分泌表达，总有相当一部分表达产物滞留于细胞内，从而也不能实现酶与细胞外底物的完全接触。这两种表达方式都导致酶的催化效率不高。

发明内容

本发明提供一种用酿酒酵母展示亚油酸异构酶催化合成共轭亚油酸的方法，将亚油酸异构酶展示在细胞壁上，可以直接接触到底物，进而提高共轭亚油酸的转化效率。

一种酿酒酵母展示亚油酸异构酶催化合成共轭亚油酸的方法，包括：

将酿酒酵母展示亚油酸异构酶加入到含有亚油酸的缓冲液中，振荡反应；

所述的酿酒酵母展示亚油酸异构酶通过如下方法制备：

将携带重组质粒的酿酒酵母K601，接种到YPG培养基中，诱导培养，离心收集菌体，洗涤，得到酿酒酵母展示亚油酸异构酶；

所述的重组质粒包括原始载体pYES2和插入原始载体pYES2的目的基因，所述目的基因由依次连接的Mfα1信号肽基因、亚油酸异构酶基因、酿酒酵母α-凝集素基因C端锚定区基因组成，所述的Mfα1信号肽基因插入到原始载体pYES2中GAL1启动子的下游。

所述的亚油酸异构酶基因lai来源于植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)lp15-2-1，其保藏号为CGMCC No.3782，该菌株的分离、纯化及鉴定方法已在中国专利申请201010251108.X中公开，GenBank号为HQ831447，碱基序列如SEQ ID NO：1所示；Mfα1酵母信号肽基因来自酿酒酵母，GenBank号为YPL187，碱基序列如SEQ ID NO：3；酵母α-凝集素C端锚定区基因sag的GenBank号为YJR004C，碱基序列如SEQ IDNO：2所示。

所述的酿酒酵母K601为标准试验菌株，它可以商业购买或从保藏机构获得。

所述的缓冲液为磷酸缓冲液。

所述的缓冲液中亚油酸的浓度为3mg/ml。

所述的振荡反应温度为28～32℃。

所述的振荡反应时间为6～80h。

本发明通过将亚油酸异构酶基因插入到载体pYES2中，导入到酿酒酵母K601中，携带重组质粒的酿酒酵母K601经诱导培养后，亚油酸异构酶通过Mfα1酵母信号肽分泌到细胞外，并利用亚油酸异构酶下游的凝集素锚定蛋白锚定在酿酒酵母细胞壁上，使亚油酸异构酶展示表达在酿酒酵母细胞外表面，直接与底物亚油酸接触，提高共轭亚油酸的转化效率，降低生成成本。

附图说明

图1是酵母细胞壁展示表达载体的结构示意图。

图2是PCR鉴定酵母转化子的电泳结果图。

图3是酵母细胞表面展示亚油酸异构酶酶活测定图。

图4酵母细胞表面展示亚油酸异构酶转化合成CLA的气相色谱图；A：阴性对照菌株(转有空载体pYES2)转化产物的气相色谱图；B：重组酵母菌菌株转化产物的气相色谱图；C：LA和CLA甲酯标样的气相色谱图，其中1为LA；2为c9t11-CLA；3为t10c12-CLA。

具体实施方式

实施例1  酵母展示重组质粒的构建