[发明专利]orexin-A载药脂质体的制备方法及用于治疗发作性睡眠的药剂

说明书

技术领域

本发明涉及一种人工合成orexin-A(食欲素A)载药脂质体的制备方法，以及含有所得载药脂质体的用于治疗发作性睡眠的两种常用药剂。

背景技术

发作性睡眠病是以不可抗拒的短期睡眠发作为特点的一种疾病，多发生于儿童和青春期的青少年，成年人偶有发生。大多数学者认为，该病是由于睡眠介质紊乱引起，部分病人有脑炎和颅脑外伤史。也可以发生在免疫功能低下、脑肿瘤、多发性硬化或者情绪紧张之后。约有10％～30％的病人有家族遗传史，多数病人没有明显的诱因。发作性睡眠的发病病因尚未完全明确，但最近有学者提出自身免疫假说。研究发现，发作性睡眠和HLA一些基因变化存在着相关性，HLA的复杂多样性可以增加机体自动免疫反应的能力，从而使下丘脑神经元产生一种名为食欲素的蛋白质，其作用是控制食欲和睡眠。而患有发作性睡眠的病人，其下丘脑内能产生食欲素的神经元明显降低。治疗发作性睡眠要根据个人症状和治疗反应，治疗可能需要数月或者更长的时间，药物要经常进行调整。目前发作性睡眠的主要治疗方案是口服安非他明、甲基苯丙胺或者莫达非尼。

Orexin-A是存在于下丘脑的一种神经多肽，参与调节摄食、睡眠-觉醒周期、生殖、体温、血压、激素分泌和感觉等生理功能。1998年Yanagisawa等在大鼠下丘脑腹外侧发现了两种与食欲有关的神经肽，命名为orexin-A(食欲素-A)和orexin-B(食欲素-B)。近年来有多项研究证实orexin系统功能受损可导致多种神经系统疾病的发生，例如睡眠障碍、急性颅脑损伤、蛛网膜下腔出血等。有研究发现，发作性睡眠的发生是由于下丘脑内orexin蛋白质表达降低所导致。因此，我们推测用脂质体包裹神经多肽orexin-A可治疗发作性睡眠。

目前国际上在使用orexin治疗中枢神经系统疾病时大部分还仅限于脑室给药，然而这种给药方式易引起损伤和感染，给临床应用带诸多不便，限制了其在临床上的应用。

发明内容

为解决orexin-A治疗中脑室给药所存在的问题，本发明的目的是提供一种采用脂体包裹orexin-A的制备工艺，可以得到纳米级orexin-A脂质体，使载药脂质体更易穿透血脑屏障，增加其脑组织药物摄入量，增加orexin-A在体内的稳定性，达到了较好的疗效。

为达到以上目的，本发明是采取如下技术方案予以实现的：

一种orexin-A载药脂质体的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：

a.将orexin-A多肽准确称量，用pH为7.2-7.6的磷酸盐缓冲液PBS，配制成20μg/ml的orexin-A原液；

b.称取400mg卵磷脂、160mg胆固醇、96mg的膜材PEG2000-DSPE，溶解于100ml三氯甲烷中得到混合液；

c.将上述混合液在常温水浴减压旋转蒸发；

d.蒸干物中滴加10ml磷酸盐缓冲液PBS，制得水性混悬液；

e.用对水性混悬液超声3～5min，冷至室温；

f.将10ml的步骤a所得orexin-A原液加入超声后的水性混悬液中室温下磁力搅拌30min，0.45μm滤膜过滤2次，即得orexin-A载药脂质体。

上述方法中，所述步骤a中，orexin-A多肽可采用商售的产品(美国Tocris公司，No.1455)，也可采用本发明自制的orexin-A多肽，其制备方法包括以下步骤；

(1)将1g的Rink-MBHAresin树脂用10ml的DMF溶液溶胀40分钟；

(2)将溶胀后的上述Rink-MBHAresin树脂用DMF溶液洗涤三次；

(3)洗涤后的Rink-MBHAresin树脂加入10ml的DMF溶液反应20分钟；

(4)在步骤(3)反应后的溶液中加入3倍于溶液质量的Fmoc-L-Leu-OH，和4倍于溶液质量的HOBT和DIC，以及10ml的DMF溶液，反应45分钟，得到连接有多肽分子的树脂；

(5)将步骤(4)连接有多肽分子的树脂用甲醇清洗，冻干后用95％三氟乙酸溶液浸泡1～2小时，将树脂上的多肽分子切掉；将切掉多肽分子后的三氟乙酸溶液迅速倒入预冷的乙醚中，得到白色沉淀即为还原型orexin-A多肽；

(6)将还原性orexin-A多肽以浓度为0.5-1mg/ml的量加入PH值为7.2-7.6的磷酸盐缓冲液PBS中，并用1％的H₂O₂氧化，12-36小时后停止氧化，得到氧化的orexin-A多肽。