[发明专利]用于直接表达肽的改进的细菌宿主细胞

权利要求书

1.制备包含多个转录盒的表达载体的方法，每个盒包括：

(1)带有编码肽产物的核酸的编码区，其符合读码框地连接到编码信号肽的核酸3′；以及

(2)可操作地与编码区连接的控制区，所述控制区包括多个启动子，

所述方法包括：

(a)使用两个基因克隆酶限制位点将所述带有编码肽产物的核酸的编码区符合读码框地克隆到克隆载体中编码信号肽的核酸的3′，从而形成克隆载体中的表达盒，其中所述克隆载体包括

(i)包括至少两个启动子的控制区；

(ii)编码信号序列的核酸；

(iii)两个基因克隆酶限制位点，其允许克隆符合所述信号序列读码框的编码肽的基因，并与所述控制区可操作地连接；

(iv)至少两个盒克隆酶限制位点，其位于所述基因克隆酶限制位点的3′；以及

(v)至少两个盒克隆酶限制位点，妻位于所述控制区的5′，其中所有所述的限制酶位点互不相同，并在所述载体中是独特的；

(b)使用在所述基因克隆酶限制位点3′的盒克隆酶限制位点处切割的第一限制酶和在所述基因克隆酶限制位点5′的盒克隆酶限制位点处切割的第二限制酶将表达盒从克隆载体上切割下来；

(c)将表达盒连接到含有步骤(b)的盒克隆酶限制位点的模板表达载体中，这样第一限制酶位点就在第二限制酶位点的3′，其中所述模板表达载体：

(i)已经用第一和第二限制酶连接，以及

(ii)至少再另外含有一对盒克隆酶限制位点，例如所述位点对的第一成员与步骤(a)的位于所述基因克隆酶限制位点3′的盒克隆酶限制位点相同，而所述位点对的第二成员与步骤(a)的位于所述基因克隆酶限制位点5′的盒克隆酶限制位点相同，其中所述位点对的第一成员在所述位点对的第二成员3′，每个盒克隆酶限制位点是模板载体上独特的，没有其它的步骤(a)的盒克隆酶限制位点落在第一盒克隆酶限制位点的5′和第二盒克隆酶限制位点的3′的区域中，或者落在盒克隆酶限制位点对第一成员5′的和盒克隆酶限制位点对第二成员3′的区域中；以及

(d)至少重复一次步骤(b)和(c)，但是使用切割任一盒克隆酶限制位点对的第一成员和第二成员的限制酶，而不是步骤(b)的第一和第二限制酶。

2.权利要求1的方法，其中在克隆载体上有三个位于所述基因克隆酶限制位点3′的盒克隆酶限制位点，它们是Asc I、Mfe I和Blp I。

3.权利要求1的方法，其中在克隆载体上有三个位于所述启动子区5′的盒克隆酶限制位点，它们是Bsp EI、Afl II和Sac II。

4.权利要求1的方法，其中所述控制区具有正好两个启动子。

5.权利要求1的方法，其中一个启动子是tac启动子，其在所述控制区中另一个启动子的5′。

6.权利要求4的方法，其中控制区包括tac启动子和lac启动子两者。

7.权利要求5的方法，其中lac启动子在tac启动子的3′。

8.权利要求1的方法，其中所述编码信号肽的核酸编码分泌的细菌蛋白的信号肽。

9.权利要求8的方法，其中所述信号是0mpA信号肽。

10.权利要求1的方法，其中克隆载体上的两个基因克隆酶限制位点是Stu I和Nco I。

11.权利要求1的方法，其中所述模板表达载体包括编码阻遏肽的核酸，所述阻遏肽能够阻遏由至少一个所述启动子控制的表达。

12.权利要求11的方法，其中编码阻遏物的核酸编码lac阻遏物。

13.权利要求1的方法，其中所述模板表达载体包括编码分泌因子的核酸。

14.权利要求13的方法，其中所述分泌因子是SecE和prlA-4。

15.权利要求13的方法，其中所述模板表达载体包括位于编码所述分泌因子的核苷酸序列5′的转录终止位点。

16.权利要求15的方法，其中所述转录终止是双rrnBT₁T₂转录终止子。

17.权利要求1的方法，其中所述肽产物具有小于10KDa的分子量。