[发明专利]用于直接表达肽的改进的细菌宿主细胞

说明书

本申请是申请日为2005年3月10日的中国专利申请200580007801.X“用于直接表达肽的改进的细菌宿主细胞”的分案申请。 

技术领域

本发明涉及直接表达肽产物到表达该肽产物的遗传工程化宿主细胞的培养基中。更特别地，本发明涉及克隆载体、表达载体、宿主细胞和/或用于高产量生产从宿主分泌出并进入培养基中的肽产物的发酵方法。在一些实施方案中，本发明涉及直接表达具有C-末端甘氨酸的肽产物，它在此后被转化为具有代替所述甘氨酸的氨基的酰胺化肽。 

背景技术

存在各种用于重组生产肽产物的技术，肽产物就是任何其分子结构包括多个通过肽键连接的氨基酸的化合物。当外源肽产物较小时的问题就是它们经常容易被表达该肽的宿主细胞的细胞质或周质中的内源蛋白酶降解。其它问题包括不改变其三级结构(它可能不令人期望的减少了发挥其基本功能的能力)而得到足够的产量并以相当纯的形式回收该肽。要解决大小较小的问题，现有技术中已经频繁地将所感兴趣的肽产物与另一(通常更大的)肽作为融合蛋白来表达，并在细胞质中积累这种融合蛋白。另一肽可能提供几种功能，例如保护所感兴趣的肽不暴露给宿主细胞的细胞质中存在的蛋白酶。一种这样的表达系统在Ray et al.，Bio/Technology，Vol.11，pages 64-70，(1993)中描述过。 

但是，用这种技术分离肽产物需要切割融合蛋白质并从宿主细胞质中正常存在的所有肽中纯化出来。这可能使许多其它可能降低方法的总效率的步骤成为必要。例如现有技术的融合蛋白在细胞质中积累时，必须经常收获并裂解细胞，在澄清步骤中去除细胞碎片。根据本发明，所有这些都被避免，其中所感兴趣的肽产物被直接表达到培养基中并从培养基中回收。 

在现有技术中，经常有必要使用亲合层析步骤来纯化融合蛋白， 这还是必须经历切割来将所感兴趣的肽与其融合配偶体分开。例如，在上述Biol Technology论文中，用溴化氰将鲑鱼降钙素前体从其融合配偶体上切割下来。这个切割步骤还是需要额外的步骤来保护鲑鱼降钙素前体1位和7位的半胱氨酸巯基基团。利用磺化作用为半胱氨酸提供保护基团。这随后又改变了鲑鱼降钙素前体的三级结构，需要在随后复性前体(当然还要除去保护基团)。 

本发明的肽产物只表达为带有信号序列，不与大的融合配偶体一起表达。本发明产生了“直接表达”。它最初表达为带有加入到N-末端侧的信号区域。然而，该信号区域是在肽产物分泌到细胞周质期间被翻译后切除的。其后，肽产物从周质扩散或者分泌到细胞外的培养基中，在此它可能以适当的三级结构被回收。它不与任何融合配偶体连接，后者的除去可能首先需要细胞裂解变性或修饰，尽管在本发明的一些实施方案中，使用了磺化来保护肽产物纯化期间的半胱氨酸巯基基团。 

现有技术中在细胞内累积肽产物的另一问题是，累积产物可能对细胞有毒，可能因此限制了可被合成的融合蛋白的量。该方法的另一个问题是，大多数产物通常是由较大的融合配偶体构成的。例如，90％的产物可能是较大的融合配偶体，这就导致只有10％的产物属于所感兴趣的肽。该方法还有另一问题是，融合蛋白可能在细胞内形成不溶的包含体，在裂解之后包含体的溶解可能不产生有生物活性的肽。 

现有技术中试图将肽与附加在N-末端上的信号肽一起表达以引导期望的肽产物分泌到周质中(参见EP 177,343，Genentech Inc.)。几个信号肽已经被鉴别(参见Watson，M.Nucleic Acids Research，Vol 12，No.13，pp：5145-5164)。例如，Hsiung et al.(Biotechnology，Vol 4，November 1986，pp：991-995)使用大肠杆菌的外膜蛋白A(OmpA)的信号肽来引导某些肽进入周质中。最经常的是，分泌到周质中的肽常常倾向于保持在那里而最少地分泌到培养基中。可能需要并不期望的进一步的步骤来破坏或通透外膜以释放足量的周质组分。一些现有技术试图将肽从周质分泌到细胞外的培养基中，包括破坏外膜屏障的完整性，其通过让宿主细胞同时表达含有信号肽的期望的肽产物与能使外膜成为可通透的或渗漏的溶胞肽蛋白(美国专利No.4,595,658)。然而，人们需要小心溶胞肽蛋白的量，以便不会破坏细胞的完整性并杀死细 胞。通过这种技术也可能使得所感兴趣的肽的纯化变得更加困难。