[发明专利]一种日本鲭和澳洲鲭的鉴别引物及其鉴别方法无效
| 申请号： | 201110107296.3 | 申请日： | 2011-04-27 |
| 公开（公告）号： | CN102304562A | 公开（公告）日： | 2012-01-04 |
| 发明（设计）人： | 程起群;黄昊;郑将臣 | 申请（专利权）人： | 中国水产科学研究院东海水产研究所 |
| 主分类号： | C12Q1/68 | 分类号： | C12Q1/68;C12N15/11 |
| 代理公司： | 上海泰能知识产权代理事务所 31233 | 代理人： | 黄志达;谢文凯 |
| 地址： | 200090 *** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 日本 澳洲 鉴别 引物 及其 鉴别方法 | ||
1.一种日本鲭和澳洲鲭的鉴别引物，其特征在于：引物序列为，
FP：5’-TTCCTATTTTGAACCCTTGTCG-3’；RP：5’-GCGTCGTGGGCTTCTGTAT-3’。
2.一种日本鲭和澳洲鲭的鉴别方法，包括：
(1)提取日本鲭与澳洲鲭肌肉组织中总基因组DNA；
(2)PCR扩增反应
引物序列为，
FP：5’-TTCCTATTTTGAACCCTTGTCG-3’；RP：5’-GCGTCGTGGGCTTCTGTAT-3’；
(3)PCR产物测序及校对
将上述PCR产物用含EB(溴化乙锭)的0.8％琼脂糖凝胶电泳回收纯化后，在测序仪上进行双向测序，其测序引物仍为PCR扩增引物，测序结果经校对拼接后，用软件进行比对，获得一致序列；
(4)D-loop碱基矩阵的构建
通过软件统计两种鲭鱼的变异位点，找出各自的固定位点，构建碱基矩阵。
3.根据权利要求2所述的一种日本鲭和澳洲鲭的鉴别方法，其特征在于：所述步骤(1)采用酚氯仿法抽提DNA。
4.根据权利要求2所述的一种日本鲭和澳洲鲭的鉴别方法，其特征在于：所述步骤(2)中的PCR扩增反应的反应体系包括：100ngDNA模板，0.2mmol/L dNTPs，引物各1.0umol/L，4.0mmol/L MgCl2，5.0uL10×reaction buffer，2U Taq聚合酶，然后加去离子水至终体积50uL。
5.根据权利要求2所述的一种日本鲭和澳洲鲭的鉴别方法，其特征在于：所述步骤(2)中的扩增程序如下：94℃预变性5min；94℃变性45s，52℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。
6.根据权利要求2所述的一种日本鲭和澳洲鲭的鉴别方法，其特征在于：所述步骤(3)使用Clustal X软件比对。
7.根据权利要求2所述的一种日本鲭和澳洲鲭的鉴别方法，其特征在于：所述步骤(4)使用MEGA4.0软件统计变异位点。
8.根据权利要求2所述的一种日本鲭和澳洲鲭的鉴别方法，其特征在于：在获得D-loop全序列后，第4位，日本鲭全部为C，而澳洲鲭全部为T，第4位即为两种鲭鱼的鉴别标记。
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