[发明专利]一种日本鲭和澳洲鲭的鉴别引物及其鉴别方法

说明书

技术领域

本发明属鲭属鱼类的鉴别技术领域，特别是涉及一种日本鲭和澳洲鲭的鉴别引物和鉴别方法。

背景技术

日本鲭(S.japonicus)与澳洲鲭(S.australasicus)在中国渔业经济中占有重要地位，其分类依据主要是传统的分类方法，利用“日本鲭腹部无斑点，澳洲鲭腹部具斑点”作为鉴别二者的最重要依据。由于两者形态特别相似，而且二者往往存在中间过渡类型，使得传统的分类方法不容易区分两者，这也导致两者的分类地位一直存有争议。日本鲭和澳洲鲭的不易区分，直接导致在渔业资源调查中，经常将二者作为一种渔业资源进行统计。显然，这对于有效管理和可持续利用日本鲭和澳洲鲭渔业资源十分不利。

在过去的数十年中，学者往往都是用形态可数性状和PCR-RFLP技术来鉴别鲭科鱼类，但上述各方法在种类鉴定时都存在一定的缺陷。例如：由于中间过渡类型的存在，使得基于形态斑点有无的方法，很难区分日本鲭和澳洲鲭；BAKER等利用第一背鳍棘数和第一背鳍与第二背鳍间的脉间骨(interneural bone)(澳洲鲭：30～33；日本鲭：26～29)数目区分印度洋及红海的澳洲鲭和日本鲭。但二者脉间骨数目相近，该方法容易出现计数错误。FUTOSHI利用PCR-RFLP技术鉴别日本鲭，澳洲鲭以及大西洋鲭。但该方法首先需自行设计特异性引物，然后通过繁琐的软件寻找合适的限制性内切酶特异性的切割三种鱼类DNA，并且电泳检测才能显示最终结果。

为有效管理和可持续利用日本鲭和澳洲鲭渔业资源，有必要查明日本鲭、澳洲鲭二者的差异，建立准确高效的线粒体控制区(D-loop)鉴别标记，从而为有效管理和合理的开发利用两种鲭鱼资源提供理论基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种日本鲭和澳洲鲭的鉴别引物和鉴别方法，该方法简单、快速、准确、高效。

本发明的一种日本鲭和澳洲鲭的鉴别引物，引物序列为：

FP：5’-TTCCTATTTTGAACCCTTGTCG-3’；RP：5’-GCGTCGTGGGCTTCTGTAT-3’。

本发明的一种日本鲭和澳洲鲭的鉴别方法，包括：

(1)提取日本鲭与澳洲鲭肌肉组织中总基因组DNA；

(2)PCR扩增反应

引物序列为：

FP：5’-TTCCTATTTTGAACCCTTGTCG-3’；RP：5’-GCGTCGTGGGCTTCTGTAT-3’；

(3)PCR产物测序及校对

将上述PCR产物用含EB(溴化乙锭)的0.8％琼脂糖凝胶电泳回收纯化后，在测序仪上进行双向测序，其测序引物仍为PCR扩增引物，测序结果经校对拼接后，用软件进行比对，获得一致序列；

(4)D-loop碱基矩阵的构建

通过软件统计两种鲭鱼的变异位点，找出各自的固定位点，构建碱基矩阵。

所述步骤(1)采用酚氯仿法抽提DNA。

所述步骤(2)中的PCR扩增反应的反应体系包括：100ngDNA模板，0.2mmol/L dNTPs，引物各1.0umol/L，4.0mmol/L MgCl₂，5.0uL10×reaction buffer(反应缓冲液)，2U Taq聚合酶，然后加去离子水至终体积50uL。

所述步骤(2)中的扩增程序如下：94℃预变性5min；94℃变性45s，52℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

所述步骤(3)优选使用Clustal X软件比对。

所述步骤(4)优选使用MEGA4.0软件统计变异位点。

通过本发明方法获得D-loop全序列后，第4位，日本鲭全部为C，而澳洲鲭全部为T，这第4位就是两种鲭鱼的鉴别标记。

MCDONALD和KREITMAN将种内个体间无碱基差异而种间有明显碱基差异的位点，定义为固定位点(fixation site)，并将其作为种间差异的标志，用以区分种内差异和种间差异。利用固定位点鉴别物种简单，快速，准确，其最突出的优点是只需建立一个“碱基矩阵”就能高效的区别相似物种。