[发明专利]P150SAL2启动子-荧光素酶真核表达载体及其制备方法

权利要求书

1.一种P150^SAL2启动子-荧光素酶真核表达载体，其特征在于：命名为p150^Sal2-luciferase表达载体，其中p150^Sal2-luciferase片段全长2278bp，其中32～2313之间为p150^Sal2promoter，2348～4000为luciferase阅读框。

2.一种P150^SAL2启动子-荧光素酶真核表达载体的制备方法，其特征是，包括如下步骤：

A、设计引物：根据p150^Sal2启动子序列设计引物，引物序列如下：

F1：5’CGCCATGGAAGCTTGTGGGGGAAGTGGAGGGCCAGGTGG-3’

R1：5’GGCCATGGCTCGAGGTGGTTTCAGCTCCCCCACCCACTG-3’

B、目的片段的克隆：以NHF细胞DNA为模板，巢氏进行PCR梯度扩增：

C、扩增产物纯化：PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，可见一条约2.4kb的扩增条带，将目的条带切下，用Gel Extraction Kit DNA纯化试剂盒进行纯化；

D、制备p150^Sal2启动子荧光素酶真核表达载体：

D-1、PCR产物、PGL3载体Xhol+HindIII双酶切，纯化；

D-2、连接：回收的p150^Sal2启动子的片段和线性的载体用T4连接酶进行体外连接反应；

D-3、转化大肠杆菌：将连接的产物转入大肠杆菌感受态细胞中，在含氨苄霉素100μl-ml的LB培养基上37℃培养12-16小时；

D-4、将茵落放大培养，纯化提取质粒；

D-5、利用PvuII+HindIII双酶切，挑取片段为1.9Kb+5.1kb的克隆，为插入p150^Sal2启动子的重组质粒，测序。

3.根据权利要求2所述的P150^SAL2启动子-荧光素酶真核表达载体的制备方法，其特征是，步骤A中所述的设计引物从人类NHF细胞DNA中通过PCR的方法用Taq酶克隆得到p150^Sal2启动子，然后经过Xhol+HindIII双酶切将启动子切为粘性末端，插入PGL3真核表达载体，构建重组的p150^Sal2-luciferase真核表达载体。

4.根据权利要求2所述的P150^SAL2启动子-荧光素酶真核表达载体的制备方法，其特征是，步骤B中所述的进行PCR梯度扩增是指采用热启动两步法进行PCR和采用热启动两步法进行PCR，其中：采用热启动两步法进行PCR：以NHF0.7μg-μL细胞DNA为模版，上游引物为F1下游引物为R1，进行PCR；采用热启动两步法进行PCR，以第一步结果中的2样品为模版，上游引物为F2下游引物为R2，进行PCR。

5.根据权利要求2所述的P150^SAL2启动子-荧光素酶真核表达载体的制备方法，其特征是，步骤D-1中所述的纯化化的方法是：PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，可见一条约2.4kb的扩增条带，将目的条带切下，用Gel Extraction Kit DNA纯化试剂盒进行纯化。

6.根据权利要求2所述的P150^SAL2启动子-荧光素酶真核表达载体的制备方法，其特征是，步骤D-2中所述的连接方法是：在反应体系中加入回收的DNA片段8μl和载体片段2μl，10倍缓冲液2μl，T4DNA连接酶1μl，去离子水7μl，16℃反应1h，PEG40001μl。