[发明专利]P150SAL2启动子-荧光素酶真核表达载体及其制备方法

说明书

本发明涉及一种药物技术领域的载体及其制备方法，具体是一种P150^SAL2启动子-荧光素酶真核表达载体及其制备方法。

背景技术

p150^Sal2属于遗传与胚胎发育相关的多锌指同源异型转录因子(multi-zinc finger homeotic transcription factor)，属于一组在哺乳动物中与果蝇Spalt直向同源(orthologs)的Sal蛋白，在遗传发育中起重要作用。在果蝇中，Spalt决定特定胚胎区域的细胞命运。Spalt在进化中非常保守，在线虫，斑马鱼，蟾蜍，鸡，小鼠和人中都发现有其直向同源的Sal基因。在人类遗传中，这组同源基因又被称作SalL(Sal-Like)基因，目前共有SalL1-SalL4四个功能基因，p150^Sal2又称SalL2。其中SalL1和SalL4基因突变都会造成人类遗传性发育缺陷，Sal3基因敲除小鼠也有发育缺陷。但现有的^Sal2基因敲除小鼠没有明显的发育缺陷，这可能是基因敲除不完全的原因，也可能是^Sal2在进化中获得了发育以外的功能，包括抑制肿瘤形成的功能。

但p150^Sal2同时可能是新的抑癌基因。人类多瘤病毒SV40T抗原靶向结合宿主抑癌蛋白使之失活，从而避免细胞过早凋亡并促进细胞分裂，以利病毒复制。我们发现多锌指转录因子p150^Sal2(^Sal2，Sall2)是多瘤病毒T抗原的结合靶蛋白，也是宿主细胞抑制病毒复制与肿瘤生成的重要调节蛋白。小鼠多瘤病毒(murine polyomavirus)是与SV40，HPV同类的小型DNA致肿瘤病毒。DNA肿瘤病毒(DNA Tumor Virus)的致癌蛋白的功能在于依靠靶向结合与修饰来改变宿主靶点蛋白的功能与活性。这些宿主的靶点蛋白通常在调节细胞的复制和生存过程中起着关键的作用，其中包括许多著名的肿瘤抑制基因(如Rb，p53)和前癌基因(如c-src)。自发肿瘤形成过程中的基因突变与细胞代谢改变常常与病毒诱发肿瘤的基因改变与代谢改变十分相似，例如抑癌基因p53突变也是自发肿瘤的重要原因之一，并且p53就是首先作为SV40大T抗原的结合靶蛋白被发现的。

多瘤病毒大T抗原靶向结合并灭活p150^Sal2的功能是我们通过在肿瘤细胞与正常细胞中宿主范围对比筛选宿主蛋白结合缺陷型病毒发现的^[8]。由此选出的失去p150^Sal2结合功能的缺陷型病毒不能在正常宿主细胞中复制并产生肿瘤，却可以在^Sal2调节通道缺陷的肿瘤细胞中生长复制。由于^Sal2在多瘤病毒侵染传播途径中的重要组织肺和肾中都有大量的表达，因而多瘤病毒有可能在进化中发展出对^Sal2靶向灭活的功能以利病毒在这些组织中的复制并造成肿瘤。

p150^Sal2的下游靶基因是揭示^Sal2抑癌调控机制的重要环节。在某些情况下独立激活p53的靶基因p21的转录后，目前我们在研究中也发现^Sal2对抑癌基因p16INK4a的表达有诱导作用。这些下游靶基因的发现使得p150^Sal2成为了相关信号通路上一个至关重要的节点基因，因此我们准备将其作为药物筛选的一个靶标。基于靶标的筛选应用比较广泛，作为药物筛选靶标的可以是某种酶，细胞表面或细胞内某种受体等，这类方法的靶标唯一，而以启动子作为筛选靶标，建立启动子-报告基因系统来表征启动子活性强弱，由于启动子的活性受多种因子影响，所以可扩大筛选范围提高筛选效率，p150^Sal2基因作为细胞信号网络中的节点基因，在许多肿瘤细胞中表达异常，其启动子的活性直接影响该基因的表达量。因此，我们构建p150^Sal2启动子与荧光素酶作为报告基因的重组质粒，可以通过瞬时转染肿瘤细胞的方式，体外加入化合物，测量化合物对于荧光素酶的影响，从而间接反映检测化合物对于p150^Sal2的影响。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的不足，提供一种P150^SAL2启动子-荧光素酶真核表达载体及其制备方法。本发明能够有效、准确、灵敏、方便和快捷发现具有肿瘤抑制潜力的化合物。

本发明是通过以下技术方案实现的：