[发明专利]一种牛奶和奶粉中维生素B12的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种维生素B12的检测方法，尤其涉及一种用于牛奶和奶粉制品中维生素B12的检测方法。

背景技术

[0003] 目前，国内外关于维生素B12的检测方法都比较复杂，一般有微生物法、高效液相法和酶联免疫法。酶联免疫法检测结果与实际数值出入较大，高效液相法检测的下限较微生物法要高出很多。

微生物法检测乳品中维生素B12是利用德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)，ATCC 7830对维生素B12的特异性，在含有维生素B12样品中生长产生的酸度和形成的光密度来测定维生素B12的含量。现有的微生物法检测维生素B12需要经过制备测试菌液、加入缓冲液和水水解，加入盐酸调整pH值进行样品前处理、制作标准曲线、灭菌、接种、培养、使用风光光度计测定。但是检测过程复杂，使用分光管妒忌需将每个样品放入比色皿，操作繁琐；容易造成交叉污染，结果重现性不好。基于上述问题，开发一种操作简单、重现性好、结果稳定的维生素B12检测方法就尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种牛奶和奶粉中维生素B12的检测方法，其操作简单、重现性好、结果稳定。

本发明提供了一种牛奶和奶粉中维生素B12的检测方法，包括：

a、将牛奶或奶粉定容混匀得到溶解液；

b、将溶解液杀菌，得到灭菌液，存储灭菌液；

c、配制维生素B12的培养基液，将培养基液杀菌得到杀菌基液，存储杀菌基液；

d、配制不同维生素B12浓度的标准品溶液；

e、分别将杀菌基液、灭菌液、德氏乳杆菌和标准品溶液加入微孔板条的相应微孔中，孵育得到测试液；

f、处理测试液，使微生物悬浊其中，用酶标仪读取它们的混浊度；

g、绘制与标准品溶液相对应的测试液中维生素B12的浓度与测试液混浊度的标准曲线；

h、将溶解液相对应的测试液的混浊度代入标准曲线中，换算得到牛奶或奶粉中维生素B12的浓度。

在一种牛奶和奶粉中维生素B12的检测方法的再一种示意性的实施方式中，步骤a中牛奶的取样量为1mL，且放入50mL的离心管中用蒸馏水或纯水定容并漩涡混匀，得到溶解液。

在一种牛奶和奶粉中维生素B12的检测方法的另一种示意性的实施方式中，步骤a中奶粉的取样量为1g，且放入50mL的离心管中用蒸馏水或纯水定容并漩涡混匀，得到溶解液。

在一种牛奶和奶粉中维生素B12的检测方法的又一种示意性的实施方式中，步骤b中溶解液在超净台用0.2μm 或0.22μm 无菌滤膜过滤杀菌，得到灭菌液，将灭菌液存储于1.5mL或2.0mL无菌试管中。

在一种牛奶和奶粉中维生素B12的检测方法的又一种示意性的实施方式中，步骤c中加入10mL无菌水至维生素B12培养基中，盖好瓶盖，摇匀，得到培养基液，将培养基液在90-100℃水浴中加热至少5 分钟，其间振荡至少2 次，迅速冷却至室温，使用0.2μm 或0.22μm 无菌滤膜过滤杀菌培养基液得到杀菌基液，将杀菌基液存储于15mL无菌离心管中。

在一种牛奶和奶粉中维生素B12的检测方法的又一种示意性的实施方式中，步骤d中配制了维生素B12浓度分别为0、0.03、0.06、0.09、0.12、0.18mg/100g的标准品溶液，且标准品溶液的配制方法为加入1.8-2.2mL无菌水至维生素B12标准品瓶中得到维生素B12标准品，用移液器溶解维生素B12标准品，用标准品瓶中的溶液冲洗移液器尖，得到标准品浓缩液，使用标准品浓缩液配制得到不同浓度的标准品溶液。

在一种牛奶和奶粉中维生素B12的检测方法的又一种示意性的实施方式中，步骤e中取与标准品溶液和灭菌液份数对应的微孔板条，分别用移液器吸取150μL杀菌基液至板条的全部微孔中，分别用移液器吸取150μL标准品溶液和灭菌液至指定的微孔中，分别用移液器吸取德氏乳杆菌5μL菌液至板条的微孔中，用粘合箔盖住微孔板条的微孔，在37℃±1℃黑暗条件下孵育44-48小时。

在一种牛奶和奶粉中维生素B12的检测方法的又一种示意性的实施方式中，步骤f中将微孔板在漩涡混合器上振荡，使微生物悬浊在测试液中，用破坏微孔测试液表面所有的泡沫，用酶标仪在610-630nm或540-550nm条件下分别读取测试液的混浊度。