[发明专利]快速检测NDM-1基因的专用引物及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速检测NDM-1基因的专用引物及其应用。

背景技术

早在人类诞生之前，细菌便开启了自己的生命历程，二战期间细菌严重威胁了人类的生命。1929年，弗莱明偶然间发现了青霉素(Penicillin)，随着抗生素药物的问世，细菌的耐药性在一些国家得到一定的控制。1961年，后英国学者Jevons首次发现了耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(Methicillin-resitant Staphylococcus aureus，MRSA)，MRSA能分泌一种酚可溶性调控蛋白(Phenol-soluble modulin，PSM)破坏人类的嗜中性粒细胞，形成严重感染——第一任“超级细菌”就此诞生。近年来抗生素滥用及抗生素累积的双重因素，使得细菌中的耐药基因不断积累，从而产生了多重抗药性。

据2010年8月11日出版的英国《The Lancet Infectious Diseases》期刊报道，目前有一种新的耐药基因在一些国家流行，一些西方医学家称其为NDM-1基因。NDM-1基因编码的蛋白被命名为“新德里金属-β-内酰胺酶1(New Metallo-β-Lactamase-1)。新德里金属-β-内酰胺酶1由269个氨基酸残基组成，与现有的其它金属-β-内酰胺酶(Metallo-β-Lactamase)的一致性不足33％，且在酶活性位点附近经常有其独特的氨基酸残基及插入序列，并能与碳青霉烯类抗生素紧密结合。NDM-1基因目前已发现于克雷伯式杆菌的180kb的质粒和大肠杆菌的140kb的质粒上。在NDM-1基因上游的2个区域中还存在能够抵抗链霉素、红霉素、氯霉素、利福平等抗生素的基因以及消毒剂和磺胺药物的多种耐药基因。由于含有NDM-1基因的质粒即能在菌株之间穿梭传递，又可以在转移中发生重组，且通过携带NDM-1基因的质粒的传递，还可使对抗生素敏感的细菌获得多重耐药性，大大增加临床抗生素使用的困难。

目前，携带有NDM-1基因的超级细菌正在全球蔓延，印度、美国、英国、澳大利亚、加拿大、法国、荷兰等多个国家已经出现了疑似病例。面对“超级细菌”的跨国传播趋势，寻找一种简便、快速、准确的耐药基因检测方法成为许多科研工作者的重大课题，也是临床实践检验中急切解决的问题。建立快速、简便、可靠的检测方法对NDM-1基因进行检测，对于指导临床的早期治疗和有效的控制超级细菌的传播具有重大意义。

LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification)法是2000年由Notomi等发明的一种新颖的恒温核酸扩增方法。该方法采用特异地识别靶序列上六个区域的四条引物(两条外引物，两条内引物)及具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在65℃左右进行核酸的指数级扩增，其扩增效率可达到10⁹-10¹⁰个拷贝数量级。整个反应仅需1小时，在扩增反应中副产物焦磷酸镁沉淀与钙黄绿素结合，产生黄绿色荧光，不需要借助其他仪器便可辨别实验结果。LAMP技术具有简便、快速、准确、廉价、易检测等特点。目前，国内外尚未见LAMP方法检测NDM-1基因的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速检测NDM-1基因的专用引物及其应用。

本发明提供的辅助检测NDM-1蛋白(新德里金属-β-内酰胺酶1)的编码基因的专用引物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA、序列表的序列4所示DNA、序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA组成。

本发明还保护一种辅助检测NDM-1蛋白的编码基因的试剂盒，包括所述的专用引物。

所述专用引物可用于制备辅助检测NDM-1蛋白的编码基因的试剂盒。

所述专用引物或所述试剂盒可用于辅助检测NDM-1蛋白的编码基因。

所述专用引物或所述试剂盒可用于辅助鉴定含有NDM-1蛋白的编码基因的生物样本。

所述NDM-1蛋白是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列7的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列7衍生的蛋白质。

所述NDM-1蛋白的编码基因为如下(1)或(2)或(3)或(4)所述的DNA分子：

(1)序列表中序列8所示的DNA分子；

(2)序列表的序列8自5’末端第14至826位核苷酸所示的DNA分子；