[发明专利]一种发现和鉴定单细胞藻类脂质生物标志物的方法

权利要求书

1.发现和鉴定单细胞藻类脂质生物标志物的方法，其特征包括下述步骤：

（1）单细胞藻类细胞内脂质化合物的提取和抗氧化保护；（2）用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱仪分析脂质化合物；（3）用Markerlynx软件提取分析数据并导入到Simca-p软件中进行正交偏最小二乘判别分析；（4）对正交偏最小二乘判别模型进行验证；（5）由正交偏最小二乘判别模型的结果筛选出潜在脂质生物标志物；（6）对潜在脂质生物标志物进行结构推断和鉴定。

2.如权利要求1所述方法，其特征在于步骤（1）用甲醇-三氯甲烷-水提取液提取单细胞藻类细胞内脂质化合物，提取液中加入抗氧化剂2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚，提取液中甲醇、三氯甲烷、水的体积比为1:1:0.5，抗氧化剂2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚与提取液的质量体积比为0.01%-0.05% g/ml；样品与提取液混合后，用振荡器震荡5-10min后，在4-10℃下离心后取下层溶液，用氮气吹干，再用0.5-1ml色谱甲醇溶解；所述样品为单细胞藻粉。

3.如权利要求1所述方法，其特征在于步骤（2）中采用超高效液相色谱与四级杆串联飞行时间质谱仪分析脂质化合物，超高效液相色谱方法中，流动相A为水、异丙醇和甲酸的混合液，其中水、异丙醇的体积比为95/5~70/30，甲酸的含量始终为流动相A的0.1%（v/v）；流动相B为乙腈、异丙醇和甲酸的混合液，其中乙腈、异丙醇的体积比为95/5~70/30，甲酸的含量始终为流动相B的0.1%（v/v）；色谱柱温为35℃-40℃，样品室温为4℃-10℃，流速为0.3-0.4 ml/min, 进样体积为1-5μl。

4.如权利要求3所述方法，其特征在于质谱分析过程分别采用电喷雾离子源正离子和负离子两种模式进行检测；正、负离子模式下的质谱参数如下：毛细管电压为2800V-3000V，锥孔电压为40-60V，离子源温度为95-105℃，电喷雾气温度为340-360℃，电喷雾气流量为580-620l/h，锥孔气流量为58-62l/h，数据采集范围在100-1000m/z。

5.如权利要求1所述方法，其特征在于步骤（3）用Markerlynx提取步骤（2）由超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱仪所采集到的数据，并将提取的数据进行归一化处理，再导入到Simca-p软件中进行Pareto标尺化处理，然后经Pareto标尺化后的数据进行正交偏最小二乘判别分析。

6.如权利要求1所述方法，其特征在于步骤（4）对正交偏最小二乘判别模型进行验证，验证方法为随机抽取80%由Markerlynx所提取的数据建立正交偏最小二乘判别模型，由该模型来预测剩下20%数据的分类情况。

7.如权利要求1所述方法，其特征在于由步骤（5）正交偏最小二乘判别分析的结果即变量重要因子值和s载荷图，筛选出潜在的脂质生物标志物；其中，变量重要因子值大于1，同时在s载荷图中纵坐标的绝对值即变量投影置信水平大于0.6的化合物作为潜在的脂质生物标志物。

8.如权利要求1所述方法，其特征在于步骤（6）对潜在脂质生物标志物进行结构推断和鉴定，其依据是Masslynx软件给出的精确分子量、元素组成、一级质谱母离子的保留时间以及二级质谱特征碎片离子分析。