[发明专利]一种发现和鉴定单细胞藻类脂质生物标志物的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物分析化学领域，涉及一种发现和鉴定单细胞藻类脂质生物标志物的方法。

背景技术

脂质化合物都是小分子化合物，它们都具有相近的物理和化学性质，它们的存在和丰度对于细胞代谢调控、能量控制、信号传导等重要生理活动至关重要。通过研究从单细胞藻类中得到的总脂提取物，可以获得脂代谢物组(lipidome)的信息(脂代谢谱)，包括了细胞内所有脂类物质的组成、相互作用和功能信息，它反映了在特定生理状态下单细胞藻类细胞内脂代谢物的整体变化，能够更详细地了解细胞受外界干扰因素所引起的脂质代谢通路和网络的改变，发现和鉴定脂质生物标志物，能够确定具有关键作用的生物分析，并有助于推测关键代谢途径的调控模式。

脂代谢物谱的分析要求高灵敏度、高通量和无偏向性的分析方法。由于脂代谢物和生物体系的复杂性，至今为止，尚无一种能满足上述所有要求的代谢组学分析技术。现有的核磁共振技术(NMR)具备快速和无偏向性的特点，但其灵敏度太低。色谱/质谱联用技术将色谱的分离能力与质谱的定性功能结合起来，实现对复杂混合物更准确的定性定量分析，也简化了样品的前处理过程。气相色谱/质谱联用(GC-MS)灵敏度较高，但其研究范围仅限于分析挥发性的物质，无法分析热不稳定性和分子量较大的代谢产物。这一缺陷正好可由液相色谱/质谱联用(LC-MS)技术来弥补。因此，LC-MS使得快速发现、灵敏检测和证实新的和不寻常的脂族化合物和脂肪酸(包括生物膜主要组分、脂类信号分子)的效率明显提高。超高效液相色谱(UPLC)耦合四级杆串联飞行时间质谱(Q-TOF)，两者的联用适合于复杂体系的分离分析和未知物的结构鉴定。

样品分型常用模式识别方法，即基于检测到的代谢物信息来建立多变量统计模型，一方面表征样品之间的关系，另一方面筛选对样品分类有重要贡献的潜在标志物。现有的常用模式识别方法是主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)。主成分分析(PCA)是一种现有的常用无师监督模式识别方法，可以直观地在多维空间上描述样品间的差异。在PCA模型中，两组之间的区别不太明显，模型仅能解释部分原始数据。偏最小二乘判别分析(PLS-DA)判别能力优于PCA，而正交偏最小二乘判别(OPLS-DA)是一种该进的偏最小二乘判别分析，其分析效果比常规的PLS-DA更有优势。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术存在的上述不足，提供一种发现和鉴定单细胞藻类脂质生物标志物的方法。

本发明的技术方案如下：

发现和鉴定单细胞藻类脂质生物标志物的方法，其特征包括下述步骤：

(1)单细胞藻类细胞内脂质化合物的提取和抗氧化保护；(2)超高效液相色谱/四级杆-飞行时间质谱(UPLC/Q-TOF-MS)分析脂质化合物；(3)用Markerlynx提取分析数据并导入到Simca-p软件中进行正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)；(4)对OPLS-DA模型进行验证(5)由OPLS-DA模型的结果筛选出潜在脂质生物标志物；(6)对潜在脂质生物标志物进行结构推断和鉴定。

上述的方法中，用甲醇-三氯甲烷-水提取液提取单细胞藻细胞内脂质化合物，提取液中加入抗氧化剂2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)。其中提取液甲醇、三氯甲烷、水的体积比为1∶1∶0.5，抗氧化剂2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)与提取液的质量体积比为0.01％-0.05％g/mi。样品与提取液混合后，用振荡器震荡5-10min后，在4-10℃下离心后取下层溶液，用氮气吹干，再用0.5-1ml色谱甲醇溶解；所述样品为单细胞藻粉。

上述的方法中，步骤(1)中单细胞藻中提取的脂质化合物采用超高效液相色谱与四级杆串联飞行时间质谱仪测定。

上述的方法中，步骤(2)中采用超高效液相色谱与四级杆串联飞行时间质谱仪分析脂质化合物，超高效液相色谱方法中，流动相A为水、异丙醇和甲酸的混合液，其中水、异丙醇的体积比为95/5～70/30，甲酸的含量始终为流动相A的0.1％(v/v)；流动相B为乙腈、异丙醇和甲酸的混合液，其中乙腈、异丙醇的体积比为95/5～70/30，甲酸的含量始终为流动相B的0.1％(v/v)；色谱柱温为35℃-40℃，样品室温为4℃-10℃，流速为0.3-0.4ml/min，进样体积为1-5μl。