[发明专利]基于细胞电子传感器的烟气冷凝物细胞毒性测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及卷烟主流烟气冷凝物细胞毒性的测定技术，具体说是涉及一种基于实时、无标记、高通量细胞传感器芯片的烟气冷凝物细胞毒性测定新方法。

背景技术

体外毒理学试验对于人类健康风险评估、卷烟危害性评价和卷烟添加材料的毒性测定具有重大意义。其中，作为CORESTA推荐方法之一的中性红试验是广泛接受的可行的体外细胞毒性测试方法。但中性红试验采用终点检测法，检测时间点的选取对检测结果有重大影响。中性红染料本身对细胞状态的影响也无法消除。此外，中性红染料染色、多个清洗步骤增加了引入人为误差的可能性。

实时、无标记、高通量细胞传感技术是把微电子细胞传感器芯片整合到表面适于细胞贴附与生长的细胞培养微孔板的底部，通过微电极的阻抗变化实时定量监测细胞的贴壁和增殖状况。细胞电子传感芯片检测的阻抗大小由仪器换算为细胞因子，来表征微电极表面细胞有无和数量多少，无需染料标记即可反映细胞的数量和状态，真正实现对细胞效应应答的实时动态检测。与中性红吸收方法相比，该系统采用了非标记，无损伤的检测技术，能够最大程度的避免中性红染料染色、清洗步骤对于细胞毒性检测结果的干扰，真实反映检测目标物毒性。细胞电子传感器简化了细胞毒性检测步骤，除了细胞接种和化合物染毒外无需其他步骤，减少了人为操作对检测结果的影响。

目前已有文献报道将实时细胞传感器用于不同化合物和新材料的细胞毒性测定，并将结果与传统的MTT分析法、中性红吸收法检测结果进行对比，取得很好的相关性。证明了利用实时、无标记、高通量细胞电子传感器取代传统细胞毒性测试方法的可行性。目前还未见文献报道将细胞电子传感器应用于卷烟烟气的细胞毒性分析。凭借自动化实时监控，无标记，高通量等一系列优势，开发基于细胞电子传感器的烟气细胞毒性测定新方法有望取得更好的准确性和重复性。

发明内容

本发明的目的旨在克服现有技术缺陷，简化细胞毒性检测步骤，无需中性红染料染色，提供一种利用细胞电子传感器测定卷烟主流烟气冷凝物细胞毒性的新方法，该方法能够通过细胞电子传感器微电极的阻抗变化实时定量监测细胞的贴壁、增殖状况以及被烟气冷凝物染毒后的细胞状态变化。通过不同浓度烟气冷凝物染毒后得到的细胞生长曲线自动求出烟气冷凝物的IC₅₀值（半数抑制量），该方法实时、无标记、高通量，对卷烟主流烟气冷凝物细胞毒性的测定更准确、重现性好。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明的卷烟主流烟气冷凝物细胞毒性的测定方法包括以下工艺步骤：

１．烟气冷凝物的制备：在ISO标准条件下平衡和抽吸卷烟，烟气总粒相物（TPM）通过静电捕集管收集。利用甲醇将烟气总粒相物洗脱后在氮吹条件下将甲醇溶剂挥发掉，最后根据TPM质量加入相应体积的DMSO溶剂，得到最终浓度为100 mg TPM/mL的标准储备液。使用前在－70 ℃以下储存。

２．基于细胞电子传感器的烟气冷凝物细胞毒性测定：

A、溶液背景扣除：首先在底部整合了细胞电子传感芯片的细胞培养板（E-plate）的每个孔中加入50μL培养基，然后将E-plate置于细胞培育箱中温浴30 min，避免由于温度变化引起阻抗信号的变化。将温浴后的E-plate放置于细胞培养箱中的芯片读取装置上，通过数据分析系统的电脑软件开始实时监控阻抗变化。首先系统自动扣除50μL培养基引起的阻抗信号变化背景，此时培养板中没有接种细胞，所以基于阻抗信号的细胞因子（Cell Index）为0。电极的阻抗信号，取决于电极/溶液界面的特性，与电极表面性质和所处溶液的电导性质相关，与电极所处溶液的体积无关。在背景扣除步骤中，加入50μL培养基与加入100μL、200μL相同培养基检测的阻抗信号没有差别（数据未列出）。

B、优化细胞接种密度：首先在细胞微电子传感芯片的各孔中加入100μL的细胞培养基进行背景扣除步骤，扣除由于液体培养基引起的微电极阻抗变化。然后取出细胞芯片，分别各孔中接种100μL不同浓度的CHO-K1细胞悬液，使得最终接种密度为1000，2500，5000， 10000，15000，20000，40000个/孔的CHO-K1细胞，每个浓度设定三孔平行。同时将只含有200μL培养基的孔作为空白对照孔。将接种细胞后的细胞芯片置于细胞培养箱中的芯片读取装置上，通过数据分析系统的电脑软件对细胞的贴壁和增殖进行实时监控。通过不同细胞接种密度下的细胞生长曲线确定最佳细胞接种密度。最终确定每孔加入100μL含有5000个CHO-K1细胞的培养基溶液