[发明专利]一种酿酒酵母gsh1缺失突变株的构建方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物学、生物化学、毒理检测技术领域，更具体涉及一种酿酒酵母的Δgshl突变株的构建方法，还涉及一种酿酒酵母的Δgshl突变株的用途，在提高重金属细胞毒性检测灵敏度中的应用，适用于其他物质细胞毒性的检测。

背景技术

随着人类的社会生产活动，环境中镉(Cd)、铅(Pd)、汞(Hg)和铬(Cr)等重金属污染越来越厉害。由于重金属可以与核酸、蛋白质等生物大分子结合，使生物大分子结构发生不可逆改变，或者产生自由基引起细胞结构和功能的破坏，甚至细胞的死亡，因此重金属具有明显的细胞毒性。重金属可以通过皮肤接触、食物链、饮水等途径直接或间接地影响人类活动，危害人体健康。如镉是常见的环境和工业污染物，具有一定的致癌性和致突变性，在动物体内半衰期长，因其毒性大、应用广泛而逐渐成为一种主要的重金属污染物。

目前检测重金属细胞毒性的方法有许多，如：MTT比色法、中性红吸收实验、台盼蓝排斥实验、蛋白含量测定、乳酸脱氢酶活性检测、细胞微核检测、DNA损伤检测、细胞存活率检测等方法，其中以V79细胞、CHL细胞、L929细胞以及酵母细胞为材料，通过检测细胞生长、存活率来评估重金属细胞毒性的实验较多。

酿酒酵母是一种单细胞真核模式生物，在生物学研究中扮演者重要的角色，不过由于酿酒酵母对重金属耐受高于动物培养细胞，虽然酿酒酵母培养、操作简单，但是在体外细胞毒性研究中表现并不突出。为了提高酿酒酵母在重金属细胞毒性检测中的灵敏度，申请人设想从降低酿酒酵母细胞对重金属的耐受性入手。

谷胱甘肽(GSH)，即γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰甘氨酸，能有效清除掉细胞体内的自由基，GSH是由前体物质L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸经γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSH I)和谷胱甘肽合成酶(GSH II)催化而合成的，其中γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶是GSH合成途径中的限速酶，由gshl基因编码。敲除酿酒酵母的gshl基因，将有效降低酿酒酵母细胞对重金属的耐受性，即采用Δgshl突变株进行细胞毒性检测可以有效提高检测灵敏度。该方法和技术思路可适用于其他物质细胞毒性的检测。

发明内容

本发明目的是在于提供了一种酿酒酵母的Δgshl突变株YJL101C，该突变株gshl基因缺失，不能有效合成谷胱甘肽，突变株细胞抗逆性下降，对重金属等胁迫因素耐受性降低、敏感度升高。

本发明的另一个目的是在于提供了一种酿酒酵母Δgshl突变株的构建方法，利用微生物遗传学方法构建酿酒酵母细胞Δgshl突变株后，再将突变株用于氯化镉等重金属细胞毒性的检测。

本发明还有一个目的是在于提供了一种酿酒酵母Δgshl突变株在提高重金属细胞毒性检测灵敏度中的应用，由于酿酒酵母的Δgshl突变株不能有效合成谷胱甘肽，突变株细胞对氯化镉等重金属耐受性低于野生型细胞，因此利用酿酒酵母的Δgshl突变株检测氯化镉等重金属的细胞毒性可以显著地提高检测的灵敏度。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：

一种酿酒酵母Δgshl突变株的构建方法，其步骤如下：

酿酒酵母Δgshl突变株构建：酿酒酵母基因同源重组敲除原理、引物设计、敲除片段转化方法按照文献所描述的方法进行(Yeast，1998，14：953-962)，该方法是目前酿酒酵母中基因敲除的通用方法；

1)引物设计：依据酿酒酵母gshl基因序列(GenBank：BK006943.1)设计引物：

上游引物P1：

GCAGATTTAGTATAGGGCTACATTGTAGGGTGGTTTAGAGTATCGAAAATATACATATAGAAGAATAAACGGATCCCCGGGTTAATTAA；

下游引物P2：

GCTTTTTCAATCACCGTGTCACCCAAATCGATAATGTCAACTTTCTTTCACAACCGAAGTAAAAGGAGTGAATTCGAGCTCGTTTAAAC；

2)PCR扩增：利用上游引物P1和下游引物P2对质粒pFA6a-Kan MX6(来源于中国典型培养物保藏中心，可以通过购买获得)进行PCR扩增，获得含酿酒酵母gshl基因上下游序列的敲除片段；