[发明专利]大孔交联海藻酸钠凝胶球的制备方法

说明书

(一).技术领域

本发明涉及一种海藻酸钠凝胶的制备方法，尤其涉及一种大孔交联海藻酸钠凝胶球的制备方法。

(二).背景技术

近年来，生物技术的发展非常迅速。运用基因工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术，已能设计、制造、生产人们急需的多种蛋白质。和其它生物产品的生产过程一样，蛋白质的生产过程一般也分为上、中、下游过程。下游技术在生物技术产品成本中占有很大比例，整个分离纯化过程所需费用约占成本的60％～80％，是生物技术产业化的关键所在。离子交换吸附剂是目前在蛋白质分离纯化中应用最为广泛的分离介质。

适用于蛋白质分离纯化的层析介质必须满足如下要求：(1)大的孔径：以便大分子量的活性蛋白扩散进出，通过表面作用或体积排阻实现蛋白质的分离。(2)应具有良好的亲水性：避免活性蛋白发生不可逆吸附或吸附变性失活。现在应用较为广泛的蛋白分离介质是交联葡聚糖、琼脂糖凝胶等。但其价格昂贵，严重制约着生物下游技术的发展。

海藻酸钠是由3-D-甘露糖醛酸和α-L-古罗糖醛酸组成的聚阴离子多糖(海藻酸)的钠盐，具有良好的生物相容性，由于含有丰富的羟基和羧基，具有高度的亲水性，价格低廉，比较容易衍生化，是一种理想的蛋白吸附介质的骨架材料。但有关海藻酸糖的研究主要集中在缓释给药系统、环境保护及负载催化剂等方面。利用其本身具有的羧基，通过交联制备具有良好蛋白吸附能力的大孔凝胶球的技术未见报道。

(三).发明内容

针对现有技术的的不足，本发明要解决的问题是提供一种大孔交联海藻酸钠凝胶球的制备方法。该方法操作简便，制得的大孔交联海藻酸钠凝胶球对牛血清白蛋白具有良好的吸附能力。

本发明所述大孔交联海藻酸钠凝胶球的制备方法，步骤是：

第一步：将重量比为1∶1-1∶8的海藻酸钠和硫酸钠的混和物溶于去离子水中，并使海藻酸钠的浓度以g/mL计为1％-4％；

第二步：将上述溶液通过直径0.1-1.0毫米的针孔滴加入浓度以g/mL计为0.5％-10％的氯化钙溶液中，其中氯化钙的总重量大于海藻酸钠和硫酸钠混合物总重量的3倍；同时搅动氯化钙溶液，待滴加完成后，继续搅动0.5-36小时，得海藻酸钠凝胶球；

第三步：将第二步制得的海藻酸钠凝胶球用纱布滤出，并用乙醇洗净；

第四步：将上述洗净的海藻酸钠凝胶球于反应器中，加入其体积量1-2倍的乙醇或异丙醇，搅拌后再加入其体积量0.2-2倍的环氧氯丙烷和以g/mL计5％-20％的NaOH，搅拌，升温至40-110℃，反应4-24小时，冷却至室温，用纱布滤出交联后的海藻酸钠凝胶球，再用乙醇洗净；

第五步：用0.05-0.2M的乙二胺四乙酸钠(EDTA)溶液或者2-5M的硝酸或者醋酸溶解步骤四方法制得的交联海藻酸钠凝胶球中的硫酸钙，再用去离子水洗净，得大孔交联海藻酸钠凝胶球。

上述大孔交联海藻酸钠凝胶球的制备方法中：步骤一所述海藻酸钠和硫酸钠的混和物中，海藻酸钠与硫酸钠的重量比优选为1∶2-1∶6。

上述大孔交联海藻酸钠凝胶球的制备方法中：步骤二所述氯化钙溶液的浓度以g/mL计优选为2-5％，继续搅动的时间优选为8-16小时。

上述大孔交联海藻酸钠凝胶球的制备方法中：步骤四所述环氧氯丙烷的加入量优选是海藻酸钠凝胶球乙醇或异丙醇溶液体积的0.5-1倍。

上述大孔交联海藻酸钠凝胶球的制备方法中：步骤四所述NaOH的加入量以g/mL计，优选是5-10g/100mL海藻酸钠凝胶球乙醇或异丙醇溶液。

上述大孔交联海藻酸钠凝胶球的制备方法中：步骤四所述反应温度优选是50-80℃。

上述大孔交联海藻酸钠凝胶球的制备方法中：步骤五所述乙二胺四乙酸钠(EDTA)溶液的浓度优选是0.1-0.15M；所述硝酸或者醋酸溶液的浓度优选是2-3M。

上述大孔交联海藻酸钠凝胶球的制备方法中，在优选的制备条件下制得的大孔交联海藻酸钠凝胶球对蛋白具有良好的吸附能力，其吸附能力通过对牛血清蛋白的吸附能力进行了表征。该交联海藻酸钠凝胶球在生物活性物质的提取和纯化方面具有广阔的应用前景。

(四).附图说明

图1：实施实例1第三步制得的海藻酸钠凝胶球的形状。随机取20个凝胶球，统计结果是：直径为2.25mm；标准偏差：0.090mm。

图2：实施实例1制得的交联海藻酸钠凝胶球冷冻干燥后的扫描电镜照片。可以看出产品具有明显的大的深孔。

图3：实施实例2制得的交联海藻酸钠凝胶球冷冻干燥后的扫描电镜照片。可以看出产品表面具有大的皱褶，但深孔较少。