[发明专利]军团菌的活菌检测方法及检测试剂盒

权利要求书

1.一种军团菌(Legionella)的活菌检测方法，该方法首先利用EMA降解待检样品中死菌胞内DNA，再提取待检样品DNA，通过荧光定量PCR检测样品中军团菌的活菌数。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

1)水样品离心浓缩处理；

2)向待检样品中加入EMA至终浓度为1～5μg/ml，暗处孵育8～12min，然后光照处理1～5min；

3)提取步骤2)处理后的样品DNA；

4)以步骤3)提取的样品DNA为模板进行荧光定量PCR检测目标菌的活菌数；

当待检样品不是水溶液时，还包括在步骤1)前将待检样品制成菌液。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，其中步骤2)向待检样品中加入EMA至终浓度为5μg/ml，4℃下暗处孵育10min；4℃下500瓦卤素灯离样本15厘米处，光照处理5min。

4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，荧光定量PCR所用引物序列为，

上游：5’-ACTATAGCGATTTGGAACCA-3’，

下游：5’-GCGATGACCTACTTTCGCAT-3’；

所用探针为：HEX-CCGCGCCAATGATAGTGTGAGGC-BHQ。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR扩增反应体系，其中20μl反应液的具体配置为：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述20μl反应液的具体配置为：

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性2min，1个循环；95℃变性5s，60℃退火20s，50个循环。

8.用于军团菌(Legionella)活菌检测的试剂盒，其包括：EMA、军团菌荧光定量检测引物和探针。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述引物为：

上游：5’-ACTATAGCGATTTGGAACCA-3’，

下游：5’-GCGATGACCTACTTTCGCAT-3’；

所述探针为：HEX-CCGCGCCAATGATAGTGTGAGGC-BHQ。