[发明专利]军团菌的活菌检测方法及检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及军团菌活菌的检测方法，本发明还涉及用于该方法的检测试剂盒。

背景技术

准确地对环境中细菌进行定性定量检测，对于有效监测病原细菌的繁殖和传播，预防疾病的发生，保障食品安全和维护公共卫生利益具有重要意义。由军团菌(Legionella)引起的军团菌病是非典型肺炎的重要组成部分，该菌是水环境中一种常见的微生物，它广泛存在于各种自然水体中，人工环境中的中央空调冷却塔水和冷凝水、冷热水管道、温泉水、游泳池以及养鱼池水都是军团菌滋生繁殖的场所。军团菌的菌体微小，人在正常呼吸时，会将空气中含有军团菌的气溶胶吸入呼吸道内，致使军团菌有机会侵染肺泡巨噬细胞，导致军团菌病的发生。由于军团菌营养要求较高以及标本中杂菌较多等因素，分离培养较为困难，因此提高空调冷却水中军团菌的检出率，对于预防军团病的发生非常重要。

目前，国内外军团菌活菌定量的检测方法主要有平板分离培养法，实时荧光定量PCR方法。前者操作繁琐，耗时较长，花费高，对培养基的要求高，条件不同的实验室之间检测的灵敏度存在较大的差异性，不易评价和质量控制。荧光定量PCR技术与细菌分离培养法相比具有特异性强、灵敏度高和操作简单、快速等优点，有利于细菌的早期检测。但其检测针对样品中核酸的存在与否以及拷贝数，并不能真正的反映样品中死菌和活菌的数量，导致假阳性率高，对于环境标本的检测其重复性和稳定性并不理想。传统金标准的军团菌检测法是当今国际上主流的军团菌检测方法。该方法被公认主要存在以下几方面不足：。(1)传统方法的检测结果误差大。条件不同的实验室之间检测的灵敏度存在较大的差异性，不易评价和质量控制。由于各个现场提供的监测数据无法直接进行比较，因此导致对各现场军团菌发生状况无法精确调查和统计，对大范围的疾病检测控制工作造成困难。(2)传统方法检测步骤繁琐，检测周期较长，花费较高，无法第一时间对军团菌的发生状况进行掌控。(刘文华，谢风，何成彦.军团菌的实验诊断方法及其研究进展[J].中国实验诊断学，2006，10(4)：427-429)。普通PCR技术与其它检测方法相比具有特异性强、灵敏度高和操作简单、快速等优点，更有利于军团菌的早期诊断。但其假阳性出现率较高，重复性和稳定性有待进一步的研究。荧光PCR已经展现出独特的优点被应用于环境中军团菌的分离和数量的检测。尽管荧光PCR的检测灵敏度比较高，但其检测结果针对样品中核酸的存在与否以及拷贝数，并不能真正的反应样品中死菌和活菌的数量。在水质检测方面，死菌DNA长期存在使基因水平的检测方法高估了样品中活菌的水平。如何快速准确的鉴定出环境水中军团菌活菌的数量，并把其和死亡菌做出正确的对比是长期以来困扰我们的一大难题。

溴乙锭类化合物是一种荧光核酸插入染料，同时也是一种抗寄生虫活性药物。单叠氮溴乙啶(ethidium monoazidem EMA)是为了光学标记DNA而合成的一种叠氮乙锭衍生物。近年来，利用其对活菌和死亡菌细胞壁的穿透作用的不同，能迅速区别活菌和死菌的技术在国外已有报道(Rueckert，A.，Rominus，R.S.，and Morgan，H.W.2005.Rapid differentiation and enum eration of the total，viable vegetative celland spore content of thermophilic bacilli in milk powders with referenceto Anoxybacillus flavithermus.J.Appl.Microbiol.99：1246-1255.)。EMA单纯只能进入那些损害细胞内的细胞壁和细胞膜，随后共价结合在细菌的DNA上。随后，通过可视光的光解作用，EMA所产生的氮烯共价链接到染色体DNA上，通过光活化反应将DNA裂解成小碎段。与此相比，未结合EMA的完整细胞仍然能在水溶液中保持一种自由的状态。也就是说，活菌细胞因具有完整的细胞壁和细胞膜，使其得到保护不受EMA共价反应的影响。EMA能选择性进入死菌的细胞质，通过光活化反应裂解染色体DNA，从而使其在荧光定量PCR反应中不能发生扩增。因此，EMA结合荧光定量PCR的方法将能区别活菌DNA和死菌DNA。

发明内容

本发明的目的在于提供一种军团菌的活菌检测方法，用以克服现有技术中无法准确快速鉴定出环境中军团菌活菌数量的问题；

本发明还在于提供一种用于军团菌活菌检测的试剂盒。