[发明专利]JAK2基因的外显子12中的突变的检测方法、以及用于所述检测方法的核酸探针和试剂盒

说明书

【技术领域】

本发明涉及JAK2基因的外显子12(exon 12)中的突变的检测方法、以及用于所述检测方法的核酸探针和试剂盒。

【背景技术】

JAK2基因的外显子12中的突变是在慢性骨髓增殖性疾病之一的真性红细胞增多症（PV）（                                                ）患者中所见的突变，该突变的有无成为真性红细胞增多症的诊断标准的一个项目（BLOOD, 30 JULY 2009 VOLUME 114, NUMBER 5）。

作为检测JAK2基因的外显子12中的突变的方法，存在用直接测序进行检测的方法（Haematologica 2007 Dec;92(12):1717-8.）、用PCR-RFLP法或等位基因特异性PCR法（Allele-Specific PCR、AS-PCR法）进行检测的方法（N Engl J Med. 2007 Feb 1;356(5):459-68.）。

Haematologica 2007 Dec;92(12):1717-8.的方法是在进行DNA提取纯化和PCR之后进行测序反应，必须用序列分析仪进行电泳等，需要工夫和成本。另外，由于在进行PCR之后，需要处理扩增产物，因此扩增产物可能混入下一反应体系，难于自动化，存在不能同时检查多个核酸序列的问题。

N Engl J Med. 2007 Feb 1;356(5):459-68.的PCR-RFLP法在进行DNA提取纯化和PCR之后，需要对扩增产物进行限制性酶处理和进行电泳等，需要工夫和成本。另外，由于在PCR进行之后，需要处理扩增产物，因此扩增产物可能混入下一反应体系，难于自动化，存在不能同时检查多个核酸序列的问题。

N Engl J Med. 2007 Feb 1;356(5):459-68.的AS-PCR法是应用序列特异性扩增引物进行PCR，通过扩增的有无来检测目的序列的有无的方法。由于该方法应用对各序列具有特异性的引物对每一引物进行反应，因此在所研究的突变为多个的情况下，反应数变多，因而需要工夫和成本。进一步地，AS-PCR法存在不能检测未知突变的问题。

另一方面，已知下述方法：用PCR扩增包含突变的区域之后，应用以荧光染料标记的核酸探针进行解链曲线分析，根据解链曲线分析结果解析突变（日本专利申请公开2001-286300号公报、日本专利申请公开2002-119291号公报）。但是，在这些文献中，关于探针的设计，仅教导了末端部通过荧光染料标记的猝灭探针（）与目标核酸杂交时，在末端部分探针－核酸杂交体的多个碱基对形成至少1个G-C对的设计。

在Haematologica 2009; 94(3):414-418.中记载了，用2个探针对来自末梢血或骨髄的ｃDNA进行解链曲线分析，除了JAK2基因的外显子12中已知的5个突变（E543-D544del、F537-K539delinsL、H538QK539L、K539L、N542-E543del）之外，还能够检测新的4个突变（D544-L545del、H538DK539LI540S、H538-K539del、V536-F547dup）。

Haematologica 2009; 94(3):414-418.的2个探针在解链曲线分析中应用，但其末端不是荧光标记的Ｇ或Ｃ。另外，在Haematologica 2009; 94(3):414-418.中示出能够检测H538QK539L突变（图1），但其灵敏度不足，另外，没有示出关于能够检测其它8个突变的数据。进一步地，在Haematologica 2009; 94(3):414-418.中，仅应用来自末梢血或骨髓的ｃDNA，没有教导能够从全血进行直接检查。

【发明内容】

本发明的课题是，提供检测JAK2基因的外显子12中的突变的方法、和用于所述方法的试剂盒，所述方法指定对检测JAK2基因的外显子12中的突变而言有效的猝灭探针。

本发明人发现，通过基于含有JAK2基因的外显子12中的突变的特定区域设计猝灭探针，应用猝灭探针通过解链曲线分析能够检测该突变，而完成本发明。

即，本发明如下。

（1）多态性检测用探针，其用于检测JAK2 外显子12基因的多态性，其特征在于，由下列（ａ）-（ｃ）中至少一种寡核苷酸构成：

（ａ）由与包含序列编号1中示出的碱基序列中碱基编号114至132的19～50个碱基长度的碱基序列互补的序列相同的序列构成的寡核苷酸，