[发明专利]一种青花菜小孢子再生植株的培养方法

权利要求书

1.一种青花菜小孢子再生植株的培养方法，包括以下步骤：

1)取青花菜的花序和油菜的花序作为小孢子培养的供体植株；直接或将花序诱导后取花蕾，得到油菜和青花菜混合花蕾；

2)将灭菌后的油菜和青花菜混合花蕾中加入NLN-13诱导培养基，研磨成悬浮液，过滤所得滤液经离心、弃上清液得到沉淀，依次加入NLN-13诱导培养基和活性炭混合液，得到小孢子混合悬浮液；

3)将小孢子悬浮液在黑暗条件下于32℃～33℃恒温热激处理1天～3天，后取出在黑暗条件下于25±2℃培养20天～30天，得到子叶期胚状体；

4)将子叶期胚状体接种至胚状体分化培养基中培养至形成胚状体；将胚状体接种到胚状体分化培养基中继续培养，直至分化，再生成芽；

5)切取再生芽接种至生根培养基上培养，将根生长健壮的苗经炼苗和移栽，得到再生植株，鉴定。

2.根据权利要求1所述的青花菜小孢子再生植株的培养方法，其特征在于，步骤1)中，所述的花蕾为花序上花瓣和花药长度比为0.7～1.2、单核晚期至双核早期的花蕾。

3.根据权利要求1所述的青花菜小孢子再生植株的培养方法，其特征在于，步骤1)中，所述的诱导的条件为：在3℃～6℃诱导0.1小时～48小时。

4.根据权利要求1所述的青花菜小孢子再生植株的培养方法，其特征在于，步骤2)中，所述的NLN-13诱导培养基为：由NLN液体培养基1L和蔗糖130g组成，pH 6.0～6.2；

所述的活性炭混合液的组成为：NLN液体培养基1L、琼脂糖2g-5g和1g活性炭；

所述的NLN液体培养基，以1L计，组成为：KNO₃125mg，Ca(NO₃)₂·4H₂O 500mg，MgSO₄·7H₂O 125mg，KH₂PO₄125mg，H₃BO₃6.2mg，MnSO₄·H₂O 18.95mg，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg，CuSO₄·5H₂O 0.025mg，CoCl₂·6H₂O 0.025mg，维生素B10.5mg，维生素B60.5mg，生物素0.05mg，叶酸0.5mg，Na₂EDTA 37.3mg，FeSO₄·7H₂O27.8mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，烟酸5mg，L-谷氨酰胺800mg，谷胱甘肽30mg，维生素B55mg，丝氨酸100mg和余量的无菌水。

5.根据权利要求1所述的青花菜小孢子再生植株的培养方法，其特征在于，步骤2)中，所述的沉淀重复以下操作1～2次：在沉淀中加入NLN-13诱导培养基，研磨成悬浮液，过滤所得滤液经离心、弃上清液。

6.根据权利要求1所述的青花菜小孢子再生植株的培养方法，其特征在于，步骤2)中，所述的小孢子混合悬浮液中小孢子的浓度为0.8×10⁵个/mL～1.2×10⁵个/mL。

7.根据权利要求1所述的青花菜小孢子再生植株的培养方法，其特征在于，步骤3)中，在黑暗条件下于25±2℃培养20天～30天的具体步骤为：在黑暗条件下于25±2℃培养至肉眼可见胚状体时，再在黑暗条件下于25±2℃条件下摇动培养。

8.根据权利要求1所述的青花菜小孢子再生植株的培养方法，其特征在于，步骤4)中，所述的培养条件为：每天12小时～18小时光照和20℃～28℃下培养。

9.根据权利要求1所述的青花菜小孢子再生植株的培养方法，其特征在于，步骤4)中，所述的胚状体分化培养基为：由MS培养基1L、蔗糖20g和琼脂10g～12g组成，pH5.8～6.1。

10.根据权利要求1所述的青花菜小孢子再生植株的培养方法，其特征在于，步骤5)中，所述的生根培养基为：由MS培养基1L、糖20g～30g和琼脂6g～7g组成，pH5.6～6.0；所述的糖为蔗糖或白糖。