[发明专利]一种青花菜小孢子再生植株的培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种青花菜小孢子再生植株的培养方法。

背景技术

青花菜(B rassica oleracea L var.italica)又名西兰花、绿菜花、茎椰菜等，是十字花科芸薹属甘蓝种中以绿色花球为产品器官的一、二生草本植物，其以主茎及侧枝顶端形成的绿色花球为产品，营养丰富，色、香、味具佳，是国际市场十分畅销的一种名特蔬菜。目前，我国青花菜主栽品种大部分都来自国外，具有我们自主知识产权的品种匮乏，究其原因是因为我们自己的青花菜育种资源很少，配制不出好的材料，因此迫切需要通过育种的手段，把市场上应用的品种进行多年自交分离。传统的多代自交分离的方法一般需要5～6年的时间才能选育到一个纯合的亲本材料，但其表现是否优良、能否与其它材料组配，以及配制出来的杂交种表现能否得到育种家们的认可还不得而知，这又需要6～8年的时间。小孢子培养方法可以在1～2年内快速获得双单倍体纯系，比传统的方法缩短了3～4年的时间，从而大大缩短了育种进程，提高了育种的效率。

自1982年Lichter首次报道油菜游离小孢子培养获得再生植株以来，芸薹属作物，尤其是油菜的小孢子培养，无论是在出胚率、出胚量，还是胚培养及再生植株方面都获得了很大的成功。相对于甘蓝型油菜、结球甘蓝等作物，青花菜游离小孢子的培养难度较大。国外研究最早见于1991年Takahata等人的报道，国内则是张德双等于1997年在巴绿青花菜等品种的研究上获得成功。随后，张延国等(中国蔬菜，2005(6)：7～9)、方淑桂等(福建农林大学学报(自然科学版)，2005，34(1)：51～55)、袁素霞(中国农业科学，2009，42(1)：189～197)等人也有报道，但青花菜小孢子胚胎发生的效率普遍不高，对难出胚的品种来说，效果很不理想。申请号为200910101722.5的中国发明专利申请中公开了一种青花菜高二倍体率小孢子再生植株的培养方法，主要涉及改变常规培养基成分和培养方法，以提高青花菜植株的二倍体率。有关芸薹属游离小孢子培养的大量研究表明，供体植株的基因型对小孢子胚胎发生的影响极为重要，它不仅影响产胚率，而且也影响胚的质量(Chuong et al.，1988)，抑制了小孢子培养育种技术的应用。因此，寻找一种提高青花菜出胚率的方法具有重要的意义。

发明内容

本发明提供了一种青花菜小孢子再生植株的培养方法，采用高出胚率的油菜品种和低出胚率的青花菜品种混合培养，得到低出胚率的青花菜小孢子苗，提高青花菜小孢子培养出胚率。

一种青花菜小孢子再生植株的培养方法，包括以下步骤：

1)取青花菜的花序和油菜的花序作为小孢子培养的供体植株；直接或将花序诱导后取花蕾，得到油菜和青花菜混合花蕾；

2)将灭菌后的油菜和青花菜混合花蕾中加入NLN-13诱导培养基，研磨成悬浮液，过滤所得滤液经离心、弃上清液得到沉淀，依次加入NLN-13诱导培养基和活性炭混合液，得到小孢子混合悬浮液；

3)将小孢子悬浮液在黑暗条件下于32℃～33℃恒温热激处理1天～3天，后取出在黑暗条件下于25±2℃培养20天～30天，得到子叶期胚状体；

4)将子叶期胚状体接种至胚状体分化培养基中培养至形成胚状体；将胚状体接种到胚状体分化培养基中继续培养，直至分化，再生成芽；

5)切取再生芽接种至生根培养基上培养，将根生长健壮的苗经炼苗和移栽，得到再生植株，鉴定。

为了达到更好的效果，优选：

所述的花蕾为花序上花瓣和花药长度比为0.7～1.2、单核晚期至双核早期的花蕾。

诱导后的花蕾也更利于小孢子的培养，所述的诱导的条件为：在3℃～6℃诱导0.1小时～48小时。

所述的油菜和青花菜混合花蕾中油菜花蕾与青花菜花蕾的用量一般不做特别的限定，为了达到更好的效果，进一步优选油菜花蕾的数量略大于青花菜花蕾的数量。

步骤2)中，所述的灭菌采用本领域常规的灭菌方法，可采用灭菌液将油菜和青花菜混合花蕾灭菌15～20分钟，清洗干净后得到灭菌后的油菜和青花菜混合花蕾。一般用于外植体灭菌的灭菌液有升汞溶液、次氯酸钠溶液等，由于升汞溶液有很大的毒性，且污染环境，对人体有害；而次氯酸钠灭菌的效果较好，没有毒害，所述的灭菌液优选次氯酸钠溶液。以1L次氯酸钠溶液计，组成为：质量百分浓度为5.6％的次氯酸钠水溶液56ml、无水乙醇100ml、洗洁精8滴～10滴和余量的无菌水。