[发明专利]鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白配体结合表位多肽及其应用

权利要求书

1.鸡传染性法氏囊病病毒IBDV  VP2蛋白配体的结合表位多肽，其特征是：所述结合表位多肽的氨基酸序列为lqsngnykfdqmlgtaqnlpasynycrlvsrsltvrsstlpgg。

2.权利要求1所述的结合表位多肽位于VP2三维结构S区域的D-E 环。

3.权利要求1所述的结合表位多肽为线性配体结合表位。

4.权利要求1所述的结合表位多肽，其特征是：所述多肽能够抑制IBDV感染鸡胚成纤维细胞CEF的多肽浓度为0.00625 ～0.2mmol/L。

5. 权利要求4所述的结合表位多肽，其特征是：所述多肽能够完全抑制IBDV感染CEF时的多肽浓度为0.2mmol/L。

6.利用权利要求1所述的结合表位多肽鉴定该多肽与CEF结合效率的方法，其特征是：该方法包括以下步骤：  

⑴ 制备CEF，37℃培养24h，直至细胞铺满96孔细胞培养板；

⑵加多肽，倾去上清液，将培养好的单层细胞用预冷的PBS洗涤3次，在培养板上依次加入浓度为0.2mmol/L、0.1mmol/L、0.05mmol/L、0.025mmol/L的用Biotin标记的多肽Biotin-P22，100μl/孔，每个浓度重复做3次，在4℃结合1h，使细胞与Biotin-P22多肽充分结合，设6孔不加Biotin标记的多肽P22的正常细胞做对照实验，设6孔加Biotin-BSA的细胞做无关多肽对照实验；

⑶ 用预冷的PBS洗涤细胞3次，洗去未结合的多肽，中止多肽结合试验； 

⑷ 固定，加入含0.3％H₂O₂的甲醇溶液，50μl/孔，4℃固定10min，倾去上清液，用PBST洗涤3次；

⑸ 封闭，加入含5％血清的PBST缓冲液，100μl/孔，37℃封闭1h；倾去上清液，用PBST洗涤3次；

⑹ 加Avidin-HRP，加入辣根过氧化酶标记的抗生物素蛋白，50μl/孔，1:500稀释，稀释液为含5％血清的PBST缓冲液，37℃作用1h；倾去上清液，用PBST洗涤3次；

⑺ 用AEC显色试剂盒显色，根据试剂盒的说明进行操作，在显微镜下观察试验结果，并记录染色细胞数目。

7.利用权利要求1所述的结合表位多肽鉴定该多肽抑制IBDV感染CEF靶细胞的方法，其特征是：该方法包括以下步骤：

⑴ 制备CEF，37℃培养24h，直至细胞铺满96孔细胞培养板；

⑵ 加多肽，倾去细胞上清液，用预冷PBS洗涤细胞一次，在培养板上依次加入浓度为0.00625mmol/L、0.0125mmol/L、0.025mmol/L、0.05mmol/L 0.1mmol/L、0.2mmol/L的P22多肽和BSA，100μl/孔，每个浓度重复做3次，稀释液为10%的DMEM，其中BSA作为无关多肽，4℃作用1h；

⑶ 加病毒：倾去含有多肽的上清液，每孔加入10倍TCID50量的 IBDV感染细胞，其中一组不加病毒只加完全培养基作为阴性对照，4℃作用1h；

⑷ 用新鲜10％的DMEM培养基洗涤细胞3次，加新培养基于感染的细胞孔中，100μl/孔，在含5%CO₂的培养箱中，37℃培养48h；

⑸ 在倒置显微镜下观察细胞病变，同时进行细胞免疫化学染色，统计感染细胞数量。

8.权利要求7所述的方法，其特征是：所述细胞免疫化学染色步骤为：

① 固定，加入含0.3％H₂O₂的甲醇溶液，50μl/孔，4℃固定10min，倾去上清液，用PBST洗涤3次；

② 封闭，加入5％血清PBST，100μl/孔，37℃封闭1h；倾去上清液，用PBST洗涤3次；

③ 加Avidin-HRP，加入辣根过氧化酶标记的抗生物素蛋白，50μl/孔，1:500稀释，稀释液为含5％血清的PBST缓冲液，37℃作用1h；倾去上清液，用PBST洗涤3次；

④用AEC显色试剂盒显色，根据试剂盒的说明操作，在显微镜下观察试验结果，并记录染色细胞数目。

9.权利要求1所述的结合表位多肽在抑制IBDV感染CEF中的应用。