[发明专利]鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白配体结合表位多肽及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子病理学与免疫学技术领域，具体涉及鸡传染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白配体的结合表位多肽及其应用。

背景技术

IBD是由IBDV引起的鸡和火鸡的一种高度接触性传染病，病毒在法氏囊的B淋巴细胞中迅速繁殖，损伤法氏囊的B淋巴细胞，引起严重的免疫抑制，往往给养鸡业带来较大的经济损失。近年来，IBDV超强毒株的不断产生，增加了对该病的防控难度。在病毒感染细胞的过程中，病毒吸附细胞是第一步也是关键步骤，这涉及病毒结合细胞的受体与细胞上的配体与病毒之间的相互作用问题，病毒必须首先结合到靶细胞表面，经受体的介导进入细胞，然后才能复制，引起相关的病理变化；因此如果找到病毒配体或者病毒受体，以其中任何一个为药靶都可以阻断病毒与受体的结合。初步研究结果获得了一些IBDV受体和配体的信息，如受体是糖蛋白，与SIgM阳性B细胞的表面分子有关，也可能是鸡热休克蛋白90；结合IBDV受体的配体蛋白是IBDV VP2，但是IBDV配体蛋白VP2与受体结合多肽表位未见报道。

应用生物技术和蛋白质技术来研究病毒受体和病毒配体，对于探明IBD发生的分子机制，阻断病毒对细胞的吸附和侵染过程，防止传染病的发生有重大意义。可以预见，发现病毒配体是最有竞争力和挑战性的课题之一。而与此相关的基础及应用研究必将极大丰富我们对病毒与宿主关系的认识，并对抗病毒疫苗及抗病毒药物的设计产生重大影响。IBDV作为无囊膜的RNA病毒，研究IBDV配体线性多肽表位，揭示该病毒的侵染机制，具有重要的理论价值和实践意义，从分子水平上探索IBDV感染细胞的机制，将为研究开发IBDV感染阻断剂药物，控制传染病的发生提供理论依据，同时也为其它传染病致病机制的研究提供借鉴和参考。本实验室已经成功制备了30多株IBDV单抗，为IBDV VP2配体结合表位的研究奠定了坚实的基础。

发明内容

本发明要解决的技术问题：

本发明提供了IBDV结合靶细胞的一条线性配体表位多肽P22的氨基酸序列，该配体表位多肽P22能够抑制IBDV感染CEF，随多肽浓度的增加感染率降低，并且得到能够完全抑制病毒感染靶细胞的多肽浓度。

还提供了细胞免疫化学染色鉴定多肽P22与CEF的结合效率及多肽抑制IBDV感染CEF靶细胞的方法。

本发明的技术方案：

本发明利用生物信息学技术，分析了IBDV的VP2蛋白氨基酸序列的一级结构，设计并合成了IBDV VP2蛋白上的1条多肽，P22命名为。以CEF为靶细胞，通过IBDV的感染、收获，测定了IBDV的毒力、半数组织培养感染剂量（TCID₅₀）和感染比（MOI），进行合成多肽与靶细胞的结合试验、病毒阻断试验和多肽阻断IBDV感染靶细胞的试验，筛选的特异性结合靶细胞能够抑制病毒感染配体表位多肽，并对IBDV的配体表位进行了精确定位。

鸡传染性法氏囊病病毒IBDV  VP2蛋白配体的结合表位多肽的氨基酸序列为lqsngnykfdqmlgtaqnlpasynycrlvsrsltvrsstlpgg。

所述的结合表位多肽位于VP2三维结构S区域的D-E 环。

所述的结合表位多肽为线性配体结合表位。

所述的结合表位多肽用Sulfo-NHS-Biotin标记多肽时，多肽与Sulfo-NHS-Biotin的摩尔比为1:1～1：4。

所述多肽能够抑制IBDV感染CEF的多肽浓度为0.00625 ～0.2mmol/L。

所述多肽能够完全抑制IBDV感染CEF时的多肽浓度为0.2mmol/L。

利用所述的结合表位多肽鉴定该多肽与CEF结合效率的方法包括以下步骤：  

⑴ 制备CEF，37℃培养24h，直至细胞铺满96孔细胞培养板；

⑵加多肽，倾去上清液，将培养好的单层细胞用预冷的PBS洗涤3次，在培养板上依次加入浓度为0.2mmol/L、0.1mmol/L、0.05mmol/L、0.025mmol/L的用Biotin标记的多肽Biotin-P22，100μl/孔，每个浓度重复做3次，在4℃结合1h，使细胞与Biotin-P22多肽充分结合，设6孔不加Biotin标记的多肽P22的正常细胞做对照实验，设6孔加Biotin-BSA的细胞做无关多肽对照实验；

⑶ 用预冷的PBS洗涤细胞3次，洗去未结合的多肽，中止多肽结合试验；