[发明专利]一种乌贼墨肽聚糖的制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种乌贼墨肽聚糖的制备方法，尤其是一种采用水提法提取乌贼墨肽聚糖的制备方法，本发明还公开了该乌贼墨肽聚糖在人前列腺癌上的应用。

背景技术

乌贼(Sepia)属于软体动物门头足纲乌贼目乌贼科。乌贼的营养丰富，除可食用外，还具有很好的药用价值。尤其是乌贼的墨汁，含有多糖类活性物质黑色蛋白，有明显的抗肿瘤活性。现有研究表明，乌贼墨具有抗肿瘤、提高免疫、抗菌、止血和延缓衰老等作用。乌贼墨作为一种废弃物，国内外的科学家们对其抗肿瘤活性进行研究，发现具有多种抗肿瘤机制，如提高免疫，诱生细胞因子，抑制癌细胞增长的作用。国内的文献可以参考《中医中药》2002年第19卷第10期，张永军等著的“复方乌贼墨胶囊对小鼠细胞免疫功能的促进作用”，又可以参考《福建中医学院学报》2004年第14卷第1期，黄枚所著的“乌贼墨抗癌活性的实验研究”，再可以参考《临床药物学》2005年第11卷第9期，王欣等所著的“乌贼墨的药理作用研究进展”。这些充分说明了乌贼墨中含有显著的抗肿瘤活性物质，且在抗肿瘤药物和功能产品开发中具有明显的潜在价值，也为充分利用海洋生物资源提供了有意义的途径。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种操作方便的乌贼墨肽聚糖的制备方法，所制备的乌贼墨肽聚糖活性高、抗肿瘤效果显著。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种乌贼墨肽聚糖在人前列腺癌上的应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种乌贼墨肽聚糖的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1)取新鲜乌贼墨匀浆，用丙酮脱脂；

2)加入2～5倍体积的0.08～0.12M浓度的Tris-Hcl缓冲液在3-5℃下浸泡8～24h进行提取，离心后超滤，或者多次上述重复提取、离心，然后合并每次上清液、再超滤；乙醇沉淀和sevag试剂除蛋白，旋转蒸发，冷冻干燥；

3)DEAE-52离子交换层析柱分离，将步骤2)中的冷冻干燥物分别用Tri s-Hcl缓冲液，NaCL溶液0.1mol/L～1mol/L进行梯度洗脱，紫外280nm检测吸光度，同时采用苯酚-硫酸法检测糖峰，收集峰值洗脱液，在490nm处检测糖峰，收集最佳峰的洗脱液，透析除盐，冷冻干燥；

4)采用Sephadex G-75凝胶柱色谱分离纯化，于280nm处检测，收集洗脱液，冷冻干燥；

5)将步骤4)所得样品进行纯度检测，通过高效液相和SDS-PAGE凝胶电泳。

作为优选，所述步骤1中的丙酮脱脂为在匀浆液中加入2～4倍体积的丙酮于-15～-25℃中进行脱脂。

作为优选，所述步骤2)中的sevag试剂的配比为氯仿与正丁醇的体积比例3∶1。

进一步优选，所述步骤3)中的梯度洗脱的洗脱速度1ml～1.5ml/min，每管4～6ml。

最后，所述步骤4)所述的Sephadex G-75凝胶柱色谱分离的步骤为：将步骤②所得样品溶于蒸馏水，过G-75凝胶柱，洗脱速度0.8ml～1.5ml/min，与280nm处检测，收集洗脱液，冷冻干燥。

一种乌贼墨肽聚糖在人前列腺癌上的应用。如在抗前列腺癌DU-145细胞抑制增殖上的应用，或者，在抗前列腺癌PC-3细胞抑制增殖上的应用。

与现有技术相比，本发明的优点在于：提取条件简便、操作易控制，且制备成本较低，同时所制得的肽聚糖对人前列腺癌细胞DU-145、PC-3具有很强的细胞抑制增殖作用，并且随药物浓度及作用时间的增加，细胞抑制率也明显增加，与为抗前列腺癌提供了一条可行性研究途径，因此具有医学药用价值，易于推广应用。

附图说明

图1为DEAE-52洗脱峰值图；

图2为G-75洗脱峰值图；

图3为柱子洗脱后样品的高效液相检测乌贼墨肽聚糖纯度检测图；

图4为SDS-PAGE电泳条带图；

图5紫外全波长扫描图；

图6为红外光谱扫描图；

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

1材料

1.1动物：乌贼购自舟山菜场，剥下墨囊-20℃冷藏备用。

1.2细胞株：人前列腺癌细胞DU-145和PC-3均购自中科院上海细胞生物学研究所细胞库。