[发明专利]一种快速筛选钙离子通道拮抗剂的方法

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种高通量筛选钙离子通道拮抗剂的方法。

背景技术

钙离子通道是常见的药物靶器官，钙离子通道拮抗剂广泛应用于心血管疾病，如高血压、心率失常和心衰等各种疾病。因其作用显著，受到各大医药公司的青睐，每年对大量化合物进行筛选以求证其对钙离子通道的作用，其中绝大部分是对其拮抗作用的筛选。

传统的钙离子通道拮抗剂的筛选方法用的是结合法（Binding Assay），这种方法是化合物和已知钙离子通道的结合位点结合，根据其结合的强弱来判断化合物的拮抗性。这种方法的缺点是结合位点已知，也就是说无法对未知的阻断结合点进行药物筛选，一般需要同位素作为检测手段，对人体和环境具有潜在的危害，更由于其筛选出的阳性化合物虽有和钙离子通道结合的能力但并不一定有拮抗的效果，因而逐渐淘汰。取以代之的以荧光为基础的Flippr Assay法， 钙离子通道开放引起的钙离子向细胞内涌入，进而结合事先置入的荧光蛋白。这类荧光蛋白可根据细胞内钙离子的强弱而发出不同强弱的荧光，从而检测荧光的强弱可判断进入细胞的钙离子的多少。最近几年兴起的PatchXpress，Qpatch 和IonWorks等仪器建立在传统的电生理的基础上，从而克服了结合法（Binding Assay）和荧光法（Flippr Assay）的缺点，使药物筛选过程更接近于生理状态, 缺点是成本很高。

无论以上哪种方法，操作人员都需要一定的专业知识，长期的训练；更重要的是筛选成本都比较高。药物筛选领域追求的是低成本高速度，即多少美元一个数据点和一天多少数据点。关于能采集多少数据点一天，以上各方法并不相同，但至少达到半高通量的要求，然而，成本却居高不下，便宜也要$50一个点左右。

发明内容

本发明针对现有技术的成本高缺陷提供一种利用细胞毒性高频筛选钙离子通道拮抗剂的方法，该方法并不需要昂贵的实验仪器，操作人员只需要简单训练即可掌握，而且也达到或超过半通量的要求，具有高效、易学、易用和廉价等优点，可快速筛选钙离子通道拮抗剂。

本发明的上述技术问题是通过以下技术方案得以实施的：

一种高效筛选钙离子通道拮抗剂的方法，该方法包括以下步骤：

1)制作稳定的带钙离子通道的细胞株；

2)剂量效应标准曲线的制备：将等量的带钙离子通道的细胞株滴入细胞培养板的各个孔内，再加入经梯度稀释的钙离子通道阻断剂，以此同时加入1μM Bay K, 培养至少24小时后测量细胞的存活率，以细胞存活率对钙离子通道阻断剂Nitrendipine的浓度绘制曲线，得到剂量效应标准曲线；

3)筛选：将带钙离子通道的细胞株滴入细胞培养板的各个孔内，每个孔内带钙离子通道的细胞株的量与步骤2)中带钙离子通道的细胞株的量的加入量相同，再向孔内加入待筛选化合物，得到的数值与剂量效应标准曲线对照，确定其是否对钙离子通道有阻断作用。

本发明是利用钙离子内流至细胞内，可引起细胞死亡这一原理而设计的。一般情况下，细胞膜内外两侧有一个在-70到-90毫伏之间的电压差（膜电压），如心肌细胞和神经细胞等。HEK293细胞相对特殊，它的膜电压在-20到-40毫伏之间。钙离子通道是一种电压敏感性通道，在处于-70之-90毫伏的静息电位时，离子通道是关闭的；细胞内外的钙离子并不交流；而电压上升到一定程度时，也就是说在某一特定的电压段，离子通道会被打开（激活状态）。-40毫伏的膜电压正好达到了钙离子通道的开放域值；HEK293细胞的膜电位真好在-20到-40毫伏之间。那么，钙离子克隆在这类细胞株上，钙离子通道将处于持续激活状态，即连接细胞内外的，在细胞膜上的钙离子通道一直处在开放状态。