[发明专利]CCR5缺失型的造血干细胞及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种自体CCR5缺失的造血干细胞及其制备方法与应用。

背景技术

艾滋病(AIDS)是威胁全人类的严重传染病。至今为止，人类尚未发明根治艾滋病的方法，也未发明有效的艾滋病预防性疫苗。高效抗逆转录病毒疗法(HARRT，俗称“鸡尾酒”疗法)可以抑制艾滋病病毒(HIV)的复制，有效缓解病情，显著降低病死率，但不能彻底清除体内的病毒，停药后病毒会迅速反弹，因此无法达到根治的目的。通过研究HIV感染细胞的过程知道，HIV通过与T细胞膜的受体CD4和辅助受体CCR5、CXCR4等细胞膜分子的相互作用而进入细胞并在细胞内复制。过去的研究已经阐明CCR5基因功能丧失(如CCR5Δ32纯合子)的人不感染HIV，但这种人可以正常生活，说明CCR5的功能并非不可或缺。最近报道一例患白血病的HIV感染者在接受CCR5Δ32纯合子供者的异体骨髓移植(治疗白血病)之后，其体内的HIV病毒载量持续在可测水平以下，在没有HAART治疗的情况下，HIV“消失”长达两年，并证明这是世界上首例通过干细胞移植获得治愈的艾滋病患者。

艾滋病的细胞移植治疗的成功为艾滋病患者带来新的希望，但这只是小概率事件，因为CCR5Δ32纯合子的人只有极少的一部分，在中国，比例更低，因此要为艾滋病患者找到相同配型的CCR5Δ32纯合子供体的机会很小。同时，尽管找到相同配型的CCR5Δ32纯合子供体，这种异体移植需要清除患者自身的骨髓细胞，因而导致大约三分之一的病人死亡，有幸存活的病人还要终生服用免疫抑制剂来对抗免疫排斥反应。而基因打靶技术，可以按要求改造目的基因，这就意味着可以将野生型CCR5变为突变失活型的CCR5。锌指核酸酶技术的出现，又极大地提高了目的基因敲除的效率。利用锌指核酸酶技术敲除CCR5基因已经在T细胞和造血干细胞中得以实现。并且，敲除CCR5基因的T细胞用于治疗艾滋病已经进入了临床试验阶段。

但传统的基于造血干细胞和T淋巴细胞的基因治疗无法逾越转染效率低和造血干细胞无法在体外有效扩增的瓶颈。诱导多潜能干细胞(iPS)技术自从2007年由日本科学家发明以来，受到了科学界的广泛重视。iPS技术可以以自体体细胞为来源，将细胞重编程为类似胚胎干细胞的多潜能干细胞，这种细胞有分化为多种组织细胞的潜能，可以在体外长期传代培养并保持未分化状态。由于iPS细胞来源于自身的体细胞，因而取材方便，同时可避免移植排斥反应。因此，将iPS细胞应用于治疗疾病，有着相当大的前景。

发明内容

本发明提供种一种制备自体CCR5缺失的造血干细胞的方法。

本发明的具体技术方案如下：

一种制备造血干细胞的方法，所述的制备方法包括如下步骤：

(1)构建CCR5特异性锌指核酸酶表达载体；

(2)构建同源重组供体质粒；

(3)对人多潜能干细胞中的CCR5基因进行敲除，并采用绿色荧光蛋白和嘌呤霉素进行筛选阳性细胞的筛选，得到CCR5基因敲除的人多潜能干细胞；

(4)诱导CCR5基因敲除的人诱导多潜能干细胞进行分化，得到CCR5基因敲除型造血干细胞。

优选的，所述的步骤(1)的CCR5特异性锌指核酸酶表达载体，其表达一对锌指核酸酶，并在该对锌指核酸酶之间通过2A序列连接。

优选的，所述的步骤(1)的CCR5特异性锌指核酸酶表达的载体具有控制CCR5特异性锌指核酸酶表达的启动子，包括CAG启动子或EF1-α启动子。

优选的，步骤(2)所述的同源重组供体质粒，其筛选标记的两端为CCR5的同源臂。

优选的，步骤(4)使用OP9小鼠骨髓基质细胞共培养诱导分化步骤(3)获得的CCR5基因敲除的人多潜能干细胞。

本发明通过在人iPS细胞中表达CCR5特异性的锌指核酸酶，特异性地切断iPS细胞的CCR5基因，随后与同源重组载体发生重组，导致CCR5基因处插入了筛选标记。将筛选标记筛选得到的iPS细胞与OP9小鼠骨髓基质细胞体外共培养，从而将iPS细胞定向分化成CCR5缺失的造血干细胞。

采用本发明上述制备方法获得的造血干细胞，所述的造血干细胞其自体CCR5缺失，并具有绿色荧光蛋白和嘌呤霉素抗性。

上述CCR5缺失的造血干细胞可应用于治疗艾滋病。

本发明将具有如下有益效果：