[发明专利]抗淋巴囊肿病毒27.8kDa受体蛋白的单克隆抗体及其制备方法

权利要求书

1.一种抗淋巴囊肿病毒27.8kDa受体蛋白的单克隆抗体，其特征在于：所述的单克隆抗体是由名称为：杂交瘤细胞ALR，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC C201128，保藏日期为：2011年4月25日的杂交瘤细胞ALR分泌的。

2.一种如权利要求1所述抗淋巴囊肿病毒27.8kDa受体蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于它包括如下步骤：培养并收集牙鲆鳃细胞，经细胞裂解及差速离心得到其细胞膜蛋白，利用电泳切胶回收提纯LCDV 27.8kDa受体蛋白，以其为抗原免疫Balb/c小白鼠，采用细胞融合制备杂交瘤细胞，经过免疫学检测筛选方法，筛选出分泌抗淋巴囊肿病毒27.8kDa受体蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞ALR，收集杂交瘤细胞株ALR培养上清液，经纯化后即得到抗淋巴囊肿病毒 27.8kDa受体蛋白单克隆抗体，并采用免疫学鉴定方法鉴定27.8kDa受体蛋白。

3.如权利要求2所述抗淋巴囊肿病毒27.8kDa受体蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的免疫学检测筛选方法包括间接酶联免疫吸附法与转印免疫印迹法。

4.如权利要求2所述抗淋巴囊肿病毒27.8kDa受体蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的免疫学鉴定方法包括间接免疫荧光法、胶体金标记免疫电镜法、阻断酶联免疫吸附法和活细胞感染阻断实验。

5.如权利要求4所述抗淋巴囊肿病毒27.8kDa受体蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的阻断酶联免疫吸附法包括以下步骤：将提纯的牙鲆鳃细胞膜蛋白以每孔100μl 加入96孔酶标板中，4℃包被过夜；吸出包被液，PBST洗涤3次，每次5min；每孔加入200μl 3%的牛血清白蛋白，37℃封闭1h；洗涤3次后，每孔加入杂交瘤细胞培养液100μl，以骨髓瘤细胞培养液为阳性对照，37℃孵育1h；洗涤3次后，每孔加入50μl提纯的淋巴囊肿病毒，以PBS代替LCDV为阴性对照，22℃孵育4h；洗涤3次后，每孔加入100μl以纯化的淋巴囊肿病毒免疫新西兰白兔制备的兔抗淋巴囊肿病毒抗体，1:1000稀释，37℃温箱孵育1h；洗涤3次后，每孔加入1:1000稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗兔Ig100μl，37℃孵育1h；每孔加入4-硝基酚磷酸盐发色液100μl，暗处反应5-30min，每孔加入50μl 2M的NaOH终止发色，稳定3-5min，以酶标仪测各孔405nm波长处的OD值；按照阻断率=（OD_阳性对照-OD_实验组）/OD_阳性对照×100%计算阻断率，当阻断率大于50%时为阳性结果。

6.如权利要求4所述抗淋巴囊肿病毒27.8kDa受体蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的活细胞感染阻断实验包括以下步骤：将生长旺盛的牙鲆鳃细胞接种到96孔板中，每孔100μl，22℃，2% CO₂培养，待细胞长成单层，用无菌PBS清洗1-2遍；将杂交瘤细胞培养液过滤后接种至单层细胞上，每孔40μl，22℃孵育4h，以骨髓瘤细胞培养液为阳性对照；吸出抗体，无菌PBS清洗3遍，每孔加入40μL 2^-2淋巴囊肿病毒，22℃吸附1h后，加入100μl含2%血清的细胞维持液，22℃，2% CO₂培养；每天在倒置显微镜下观察细胞病变（CPE），并进行拍照。