[发明专利]一种表达载体及其构建和应用

权利要求书

1.一种表达载体，其特征在于，在线性化载体的非目的基因的两端加入Loxp序列，同时引入诱导表达启动子组分，启动Cre酶表达。

2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括：

Ptight(bp 33-348)选择性启动子，由Tet-On Advanced蛋白亚基与四环素类似物共同启动；

Cre(bp 371-1402)表达Cre酶，识别两段Loxp序列，并发生同源重组；

SV40 PolyA(bp 1403-1603)多聚腺苷酸信号；

LoxP(bp 1619-1652)、(bp 1690-1723)，Cre酶识别序列；

MCS(bp 1654-1689)多克隆位点，用于插入目的基因；

CMV启动子(bp 1829-2429)，启动Tet-On Advanced、TK、DsRed的表达；

Tet-On Advanced(bp 2381-3124)表达Tet-On Advanced蛋白亚基，在四环素的共同作用下，可以激活Ptight启动子，启动Cre酶转录和表达；

T2A序列(bp 3134-3193)；

TK胸苷激酶(bp 3194-4324)，使丙氧鸟苷三磷酸化，抑制DNA聚合酶活性；

IRES序列：(bp 4357-4941)；

DsRed2(bp 4961-5638)红色荧光蛋白基因，选择标记基因；

Psv40启动子(bp 65514-6784)，启动抗性基因的表达；

KanR/NeoR(bp 6867-7661)是卡那霉素和新霉素的抗性基因；

HSV TK PolyA(bp 7897-7915)多聚腺苷酸信号。

3.根据权利要求1所述表达载体，其特征在于，其序列如序列表SEQ：ID NO：1所示。

4.一种表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)合成loxP-MCS-loxP序列，并通过EcoRI和SalI酶切连接到pDsRed2-1质粒，得到的质粒命名为pDsRed-LoxP；

2)从pIRES2-EGFP上通过PCR得到CMV启动子，在引物的两端引物Sal I和Asp 718 I酶切位点，命名为Pcmv；

3)将PCR所得片段经酶切后连接到pDsRed-LoxP质粒中，得到pDsRed-LoxP-CMV质粒；

4)对已知质粒查询，获得Tet-On Advanced组件、TK基因和IRES序列，并在Tet-On Advanced和TK基因之间引入T2A多肽，并在整体片段的两端设计Asp718 I和BamH I酶切位点，命名为Tet-On TK；

5)将步骤4中所合成基因片段双酶切后连接到pDsRed-Loxp-CMV质粒中，命名为pTet-On RL质粒；

6)查询GeneBank中Cre酶基因，通过密码子优化后并在两端加入EcoR I和Xba I酶切位点，合成后命名为Cre；

7)将步骤6合成的Cre酶基因经EcoR I和Xba I双酶切，连接到pTRE-Tight质粒中，经Xho I单酶切后得到的片段命名为Ptight-Cre；

8)将质粒pTet-On RL用Xho I单酶切后，与Ptight-Cre片段连接，得到名称为pTRE Tet-On RL的质粒。

5.权利要求1至3任一所述的表达载体在制备转基因动物中的应用。

6.根据权利要求5所述的载体在制备转基因动物中的应用，包括如下步骤：

a.基因转染细胞，表达载体连接目的基因并线性化后，转染细胞并插入到细胞基因组中，启动子同时驱动Tet-On Advanced蛋白亚基、胸苷激酶和红色荧光蛋白基因的表达；

b.转基因细胞的富集，基因转染48小时后，添加G418筛选；

c.红色荧光蛋白进行二次筛选；

d.转基因细胞中外源标记基因的删除，经12-15天培养后，挑选稳定表达红色荧光蛋白的细胞团，经扩大培养后，在培养液中添加强力霉素，强力霉素与Tet-On Advanced蛋白亚基的共同作用下激活Ptight启动子转录表达Cre酶，Cre酶识别两个同向Loxp序列并引起同源重组，删除载体中非目的基因的序列，而原位点只保留了目的基因；

e.同源重组细胞的富集，由于TK基因单独表达不会表现出细胞毒性，在丙氧鸟苷的作用下，阻止DNA合成而导致细胞死亡，细胞培养液中添加强力霉素后，经传代培养1-2代后加入丙氧鸟苷，在TK基因的作用下，未发生重组和重组删除后又重新连接到基因组中的细胞因DNA合成受阻而死亡，得到成功转染目的基因，同时又能成功删除荧光蛋白和抗性基因等存在生物安全隐患的外源基因的细胞；

f.然后再利用步骤e得到的外源基因的细胞用于核移植供体，从而得到无外源标记基因的安全型转基因动物。