[发明专利]一种表达载体及其构建和应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子遗传学技术领域，具体地说是一种表达载体及其构建和应用。

背景技术

具有优良性状的良种家畜一直是畜牧业的重要资源，但是优良性状的培育是一个漫长的过程，而且不确定因素还很多。通过转基因技术可以定向、快速的培育良种家畜的优良性状，2006年8月，世界第一个利用转基因羊乳腺生物反应器生产的人药重组蛋白在欧洲获得上市，它标志着转基因动物是可以为人类服务的。目前，世界各国纷纷加大投资和研发力度，力求在转基因育种技术的激烈国际竞争中取得领先，中国也启动了“转基因重大专项”，可见转基因技术已经成为我国和世界研究和发展的热点。

转基因细胞和转基因动物的生产需要通过载体来导入外源DNA，为了从众多的非转基因细胞中筛选出转基因细胞，几乎所有的导入载体都带有标记基因，对转基因动物生产的应用等方面存在潜在的安全隐患，限制了转基因动物安全证书的申请。

Cre酶可以识别两段Loxp序列，如果同一段DNA上两个Loxp序列方向一致，Cre酶会将两个Loxp序列间的DNA切除。目前将cre-loxp系统应用于转基因的方式，是将Cre酶和loxp系统分开转染，增加了工作量，同时，由于Cre/Loxp系统的可逆性，降低了细胞转基因和转基因动物的成功率。

由此可见，上述现有的表达载体在结构与使用上，显然仍存在有不便与缺陷，而亟待加以进一步改进。为了解决现有的表达载体存在的问题，本发明人基于从事此类技术研究多年丰富的实务经验及专业知识，并配合学理的运用，积极加以研究创新，以创设一种新型结构的表达载体，以改进一般现有转基因表达载体存在的缺陷，使其更具有实用性。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种表达载体，增加了转基因动物的安全性。

为了解决上述技术问题，本发明采用了如下技术方案：

一种表达载体，在线性化载体的非目的基因的两端加入Loxp序列，同时引入诱导表达启动子组分，启动Cre酶的表达。

进一步，所述表达载体包括：

Ptight(bp 33-348)选择性启动子，由Tet-On Advanced蛋白亚基与四环素类似物共同启动；

Cre(bp 371-1402)表达Cre酶，识别两段Loxp序列，并发生同源重组；

SV40 PolyA(bp 1403-1603)多聚腺苷酸信号；

LoxP(bp 1619-1652)、(bp 1690-1723)，Cre酶识别序列；

MCS(bp 1654-1689)多克隆位点，用于插入目的基因；

CMV启动子(bp 1829-2429)，启动Tet-On Advanced、TK、DsRed的表达；

Tet-On Advanced(bp 2381-3124)表达Tet-On Advanced蛋白亚基，在四环素的共同作用下，可以激活Ptight启动子，启动Cre酶转录和表达；

T2A序列(bp 3134-3193)；

TK胸苷激酶(bp 3194-4324)，使丙氧鸟苷三磷酸化，抑制DNA聚合酶活性；

IRES序列：(bp 4357-4941)；

DsRed2(bp 4961-5638)红色荧光蛋白基因，选择标记基因；

Psv40启动子(bp 65514-6784)，启动抗性基因的表达；

KanR/NeoR(bp 6867-7661)是卡那霉素和新霉素的抗性基因；

HSV TK PolyA(bp 7897-7915)多聚腺苷酸信号。

进一步，所述表达载体的序列如序列表SEQ：ID NO：1所示。

本发明的另一目的为提供一种上述表达载体的构建方法。其技术方案如下：

一种表达载体的构建方法，包括如下步骤：

1)合成loxP-MCS-loxP序列，并通过EcoRI和SalI酶切连接到pDsRed2-1质粒，得到的质粒命名为pDsRed-LoxP；

2)从pIRES2-EGFP上通过PCR得到CMV启动子，在引物的两端引物Sal I和Asp 718 I酶切位点，命名为Pcmv；

3)将PCR所得片段经酶切后连接到pDsRed-LoxP质粒中，得到pDsRed-LoxP-CMV质粒；