[发明专利]肠球菌的快速检测方法及检测引物组和检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属微生物检测领域，涉及一种肠球菌快速检测方法及其检测引物组和检测试剂盒。

背景技术

肠球菌（Enterococcus）属链球菌科，是人类和动物肠道正常菌群的一部分，对冷热的耐受力较强，通常在引起腹腔和盆腔感染所分离的混合菌丝中发现。既往认为肠球菌是对人类无害的共栖菌，但近年研究和临床病例已证实了肠球菌的致病性。在需氧革兰阳性球菌中，它是仅次于葡萄球菌的重要院内感染致病菌；肠球菌亦可引起院外感染。肠球菌不仅可引起尿路感染、皮肤软组织感染，还可引起危及生命的腹腔感染、败血症、心内膜炎和脑膜炎等。肠球菌也可引起食物中毒，常见中毒食品为奶及奶制品、肉类制品等，而由肠球菌引起的食物中毒的报道也逐渐增加。卫生学家认为，肠球菌类似于大肠菌群的生态活动，但对外环境抵抗力更强，作为监测水质卫生，环境卫生质量的污染指标更具有卫生学意义。同时，由于肠球菌还对多种抗生素呈固有耐药，又易产生获得性耐药，因此对肠球菌的污染情况及其流行趋势的监测十分重要。

根据文献报道，当食品中肠球菌的污染量达到10⁵/g时，可引发食物中毒，而对于免疫系统发育不完善的新生儿和免疫力低下的成年人群，更低的肠球菌污染量便可引发食物中毒。现行有效的国家标准已对部分食品作出了肠球菌的限量要求（如饮用天然矿泉水规定为不得检出）。目前食品检测过程中主要以平板分离鉴定为主对该菌进行检测，操作均较为复杂，且耗时长，不能及时为突发事件提供判断依据。随着分子生物学技术的快速发展，环介导等温扩增技术（Loop–Mediated Isothermal Amplification, LAMP）已逐步应用于食源性致病菌的检测。

LAMP方法是一种新型的恒温核酸扩增技术，该技术主要利用4种不同的特异性引物识别靶DNA上6个特定区域，并利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶（BstDNA），在恒温条件下快速扩增核酸，保证了扩增的高特异性和高效率。由于LAMP独特的核酸扩增机制，它的产物是由多重复靶序列的茎一环状DNA和花椰菜状DNA所组成的混合物，在琼脂糖凝胶电泳上会呈现出LAMP反应典型的阶梯状条带；同时，核酸大量生成时，从dNTPs中析出的焦磷酸根离子与反应体系中的Mg²⁺结合，产生肉眼可见的扩增反应副产物-白色焦磷酸镁沉淀；另外，由于扩增产物大量生成，加入荧光染料（如Syber Green I、溴化乙锭、Gel Red等）。因此LAMP扩增结果不但观察方式多样，且结果鉴定简单，非常适合高通量的快速检测。

鉴于LAMP技术有众多优势，现已被用于病原微生物的检测，如分支杆菌属、阪崎肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等。现尚未见有LAMP应用于肠球菌检测的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种肠球菌的快速检测方法及检测引物组和检测试剂盒。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：肠球菌的检测引物组的外引物的上游引物具有如SEQ No.1所示的序列，其外引物的下游引物具有如SEQ No.2所示的序列；其内引物的上游引物具有如SEQ No.3所示的序列，其内引物的下游引物具有如SEQ No.4所示的序列。

使用本发明所述引物组对肠球菌进行快速检测的方法是：利用所述引物组对待测样品的DNA进行LAMP反应，反应结束后对反应液进行阴阳性判定。

进一步地，本发明所述LAMP反应按以下第一种方案或第二种方案进行：

第一种方案：所述LAMP反应在59.5-62.5℃下反应50-70min；

第二种方案：所述LAMP反应包含以下步骤：

（1）先在59.5-62.5℃下反应50-70min；

（2）后在80℃下反应6-12min。

进一步地，本发明在进行所述LAMP反应的反应液中，包含浓度均为0.15-0.25μM的所述外引物的上游引物和下游引物、浓度均为0.6-1.0μM的所述内引物的上游引物和下游引物，浓度为0.6-0.7 M的甜菜碱，浓度为4.0-5.6mM的Mg²⁺，10 %（体积）的10×BstDNA聚合酶缓冲液，浓度为0.2-0.4U/μL的BstDNA聚合酶，各浓度为0.6-1.0mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸。