[发明专利]一种产胆盐水解酶的乳酸菌及其筛选方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种产胆盐水解酶的乳酸菌及其筛选方法和应用，属于食品生物技术领域。

背景技术

益生菌是指对人和动物机体有益的微生物。它包括干酪乳杆菌、嗜热链球菌、双岐杆菌、嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌、植物乳杆菌、发酵乳杆菌等。它们通过改善肠道微生物生态平衡，控制肠道感染，降低血清胆固醇水平，提高乳糖不耐症人对乳糖的利用，并能刺激特异性或非特异性免疫反应，具有增强机体免疫力的作用。主要用于乳品、肉制品、水产品等发酵食品和一些功能食品的生产。

血清中高胆固醇含量被认为是诱发高血压、冠心病等众多心血管疾病的重要因素。统计表明，心血管疾病是目前引起人类死亡的主要杀手，而且其患病率和死亡率仍呈逐年上升的趋势。因此，降低血清胆固醇水平直接关系到人类的健康，也是目前科学研究工作的热点之一。国内外大量临床实验证实，服用益生菌及其相关制品具有减少人体血清胆固醇含量，降低心血管疾病发病率的功效。1974年，Mann和Spoerry发现，非洲Masai人大量饮用由乳杆菌发酵的乳制品，其体内血清胆固醇含量普遍较低。1977年，Gilliland对肠道乳杆菌的降胆固醇作用进行了研究，提出了乳酸菌在生长过程中通过降解胆盐促进胆固醇的分解代谢，从而降低胆固醇含量的观点。然而，益生菌的降胆固醇作用与其所产生的一种酶-胆盐水解酶(Bile Salt Hydrolase，BSH)可能有着密切的联系，所以研究胆盐水解酶的特性对于揭示益生菌降胆固醇的作用机理具有重要意义。

关于乳酸菌降低血清胆固醇的机理，目前尚未有定论。目前国内外研究者们的观点主要有以下几种：(1)吸收同化理论认为，在体外厌氧条件下，乳酸菌在含胆盐的高胆固醇培养基中生长时，菌体细胞直接吸收同化介质中的胆固醇，从而导致介质中的胆固醇含量下降；(2)共沉淀理论认为乳酸菌和双歧杆菌对胆固醇没有吸收同化作用，而是BSH使结合态胆盐转变为游离态胆盐，后者在酸性条件下溶解度降低与胆固醇发生共沉淀；降解后的胆盐为游离胆盐，且其在肠道的溶解度和被吸收能力均比结合态胆盐差，可以粪便的形式排出体外，由此导致了胆固醇的代谢加速，达到降低血清胆固醇水平的效果；(3)其他理论。国内外大部分学者认为是吸收同化和共沉淀的共同作用。

由于BSH增强了菌株对胆汁的耐受性、在肠道中的存活能力和持续繁殖能力。因此，筛选具有这种酶的益生菌是有必要的。目前国内外通常采用琼脂平板试验来检测，但是这种筛选方法的灵敏度不够，只适合筛选具有较高BSH活性的菌(如双歧杆菌)。本发明对上述方法加以改进，使它可以用于筛选能够分泌胆盐水解酶的乳酸菌。

发明内容

本发明提供了一种筛选产胆盐水解酶的乳酸菌的方法，包括如下步骤：

1)定性筛选：将乳酸菌菌体洗涤重悬，破碎菌体收集上清液，将上清液点到含有胆盐的MRS固体培养基平板上，以不加胆盐的MRS固体平板做对照，37℃厌氧培养48小时左右；

2)定量筛选：将乳酸菌细胞破壁上清液(粗酶液)与5mM甘氨脱氧胆酸钠(GDCA)或5g/L牛磺脱氧胆酸钠(TDCA)在缓冲液中一起孵育，然后用茚三酮显色液测定上述反应产生的甘氨酸或牛磺酸的量。所述MRS培养基如下：葡萄糖20g L^-1，蛋白胨10g L^-1，牛肉膏10g L^-1，酵母浸出汁5g L^-1，无水乙酸钠5g L^-1，磷酸二氢钾2g L^-1，柠檬酸氢二铵2g ^L-1，MgSO₄·7H₂O 0.58gL^-1，MnSO₄·4H₂O 0.25g L^-1，Tween-801mL L^-1，pH 6.5。

所述破碎过程的缓冲液为0.1M磷酸钠缓冲液(pH 7.0)，破碎菌体的仪器采用超声波细胞破碎仪，破碎条件为破碎20min(工作时间∶间歇时间＝2∶3)，振幅为20％。

所述含有胆盐的MRS固体培养基如下：MRS液体培养基中加入1.5％琼脂粉，再加入0.37g/L的氯化钙和5g/L牛磺脱氧胆酸钠(TDCA)(或5mM甘氨脱氧胆酸钠(GDCA))，其中TDCA和GDCA要过滤除菌，而且在培养基灭完菌稍微冷却后加入。