[发明专利]在昆虫细胞中表达重组人骨形态发生蛋白的方法无效
| 申请号： | 201110120294.8 | 申请日： | 2011-05-09 |
| 公开（公告）号： | CN102776198A | 公开（公告）日： | 2012-11-14 |
| 发明（设计）人： | 刁爱坡;王飞;许丽红;罗深恒 | 申请（专利权）人： | 扬州泰达生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/12 | 分类号： | C12N15/12;C12N15/866;C12N7/01;C07K14/495;C07K1/22 |
| 代理公司： | 北京市金杜律师事务所 11256 | 代理人： | 杨宏军;尚继栋 |
| 地址： | 225117 江苏省*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 昆虫 细胞 表达 重组 形态 发生 蛋白 方法 | ||
1.一种利用昆虫细胞-杆状病毒蛋白质表达系统表达制备人骨形态发生蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将人骨形态发生蛋白成熟肽基因片段克隆到昆虫细胞-杆状病毒表达载体上，共转染第一昆虫细胞，培养该细胞，制备带有人骨形态发生蛋白成熟肽基因片段的重组杆状病毒；
(2)用步骤(1)制备的重组杆状病毒感染第二昆虫细胞，培养该细胞，获得表达的人骨形态发生蛋白；
(3)经亲和层析纯化步骤(2)获得的表达的人骨形态发生蛋白。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述骨形态发生蛋白为BMP2或BMP7。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述第一昆虫细胞为sf9昆虫细胞。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述第二昆虫细胞为High5昆虫细胞。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述亲和层析在Ni-亲和柱上进行。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述Ni-亲和柱纯化变性状态的人骨形态发生蛋白，并在纯化柱上直接复性人骨形态发生蛋白成熟肽。
7.一种利用昆虫细胞-杆状病毒蛋白质表达系统表达制备人骨形态发生蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)分别在人BMP2、BMP7成熟肽基因N-端加入6xHis标签，并将该基因片段克隆到改进的昆虫-杆状病毒表达载体上，然后共转染sf9昆虫细胞，培养后收集转染上清培养液，用蛋白酶K裂解杆状病毒，以病毒基因组DNA为模板进行PCR鉴定，制备出带有BMP2或BMP7成熟肽基因片段的重组杆状病毒；
(2)将步骤(1)制备的重组病毒上清液大量感染sf9昆虫细胞，培养后收集重组病毒上清液，再大量感染High5昆虫细胞，培养后离心收集细胞，溶于裂解液中；
(3)离心步骤(2)获得的裂解液，上清液过Ni-亲和柱，用缓冲液清洗后，用洗脱液洗脱蛋白，蛋白洗脱液再经PD10柱脱盐，得到纯化的BMP2或BMP7。
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