[发明专利]在昆虫细胞中表达重组人骨形态发生蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及利用昆虫细胞-杆状病毒蛋白质表达系统在昆虫细胞中高效表达具有生物活性的重组人骨形态发生蛋白BMP2、BMP7的新技术方法。

背景技术

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是1965年首次发现的一种能诱导常位及异位成骨的蛋白质，具有诱导间充质细胞和骨祖细胞分化为软骨细胞和成骨细胞从而诱导新骨生成的能力。目前已鉴定并克隆出20多种BMP，它们属于转化生长因子β(transforming growthfactor，TGF-β)超基因家族中的成员。BMP2是目前研究最为广泛、诱导成骨活性最强的BMP之一。BMP7主要在骨和肾中表达，具有强大的骨诱导活性，能刺激未分化的间充质细胞增殖及其向成骨细胞或软骨细胞方向分化，并促进成骨细胞的增殖和碱性磷酸酶的分泌。由于骨形态发生蛋白BMP具有高效诱导成骨活性，因而有重要的临床应用价值，包括用于修复骨缺损；用于脊柱融合术；治疗股骨头坏死；修复牙槽骨缺损。

近年来基因重组的人骨形态发生蛋白BMP2和BMP7的安全性和有效性得到了充分的证实，美国FDA也于2002年7月批准重组人骨形态发生蛋白BMP2、BMP7用于脊柱融合和骨缺损修复。但由于利用动物细胞制备的重组人骨形态发生蛋白表达量低，制备成本高，致使治疗成本高达6000-10000美元，从而大大限制了BMP在临床上的应用。

昆虫细胞-杆状病毒蛋白质表达系统由于其操作安全，表达量高，成本低，表达蛋白质经糖基化修饰易于折叠和产生高活性的特点，已被广泛应用于生产药用蛋白质。利用昆虫细胞-杆状病毒蛋白质表达系统高效表达生产重组人骨形态发生蛋白BMP2、BMP7成熟肽，能够大大降低其制备成本。

发明内容

本发明的目的是利用昆虫细胞-杆状病毒蛋白质表达系统，高效、低成本地表达具有诱导成骨活性的重组人骨形态发生蛋白，特别是BMP2、BMP7成熟肽，使其在临床上得到广泛应用成为可能。

本发明提供一种利用昆虫细胞-杆状病毒蛋白质表达系统表达制备人骨形态发生蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将人骨形态发生蛋白成熟肽基因片段克隆到昆虫细胞-杆状病毒表达载体上，共转染第一昆虫细胞，培养该细胞，制备带有人骨形态发生蛋白成熟肽基因片段的重组杆状病毒；

(2)用步骤(1)制备的重组杆状病毒感染第二昆虫细胞，培养该细胞，获得表达的人骨形态发生蛋白；

(3)经亲和层析纯化步骤(2)获得的表达的人骨形态发生蛋白。

在一个实施方案中，所述骨形态发生蛋白为BMP2或BMP7。在另一个实施方案中，所述第一昆虫细胞为sf9昆虫细胞，所述第二昆虫细胞为High5昆虫细胞。

在一个优选实施方案中，上述方法的步骤(3)中进行的亲和层析在Ni-亲和柱上进行。在更优选的实施方案中，所述Ni-亲和柱纯化变性状态的BMP2或BMP7，并在纯化柱上直接复性BMP2或BMP7成熟肽。在更优选的实施方案中，上述步骤(3)还包括脱盐，例如经PD10柱脱盐。

附图说明

图1显示人BMP2、BMP7成熟肽的氨基酸序列与相应的核酸序列。所述序列也记载在序列表中。BMP2含114个氨基酸，BMP7含139个氨基酸。

图2是重组杆状病毒样品经PCR扩增后的凝胶电泳图，证实了制备的重组杆状病毒DNA包含编码BMP2或BMP7成熟肽的DNA片段。M，DNA Marker；1，阴性对照；2，BMP2阳性对照；3，含BMP2的病毒；4，BMP7阳性对照；5，含BMP7的病毒。

图3显示BMP2或BMP7成熟肽在昆虫细胞High5中的表达。M，蛋白Marker；d1，第1天；d2，第2天；d3，第3天。

图4显示BMP2或BMP7成熟肽的纯化。M，蛋白Marker；T，昆虫细胞总裂解物；P，纯化蛋白。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明。下述实施例是说明性的，而不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

在昆虫细胞中高效表达重组人骨形态发生蛋白BMP2、BMP7成熟肽的方法步骤如下：

(1)重组杆状病毒的制备与鉴定