[发明专利]通过VP7基因快速检测A组轮状病毒G基因型的新方法

权利要求书

1.通过VP7基因快速检测A组轮状病毒G基因型的新方法，其特征在于：包括设计能特异性扩增不同G基因型的六条核苷酸序列，作为检测不同基因型的引物，引物分别为：①：5′-gctccttttaatgtatggtattg-3′；②：5′-taagaaacatttgcgataatgag-3′；③：5′-ggacaaacttttaccgtacagtc-3′；④5′-ttctagttaaggatttgagtacg-3′；⑤5′-tcagatatgtccaactcctcacc-3′；⑥5′-ttgaagtcaaaaacgtttcttgc-3′。引物长度均为23bp，将其结合到轮状病毒VP7基因的模板上，可特异性的扩增出大小不同的目的序列。3)在待测样品中加入200uL的PBS，然后进行3000g的离心力离心30秒，吸取上清，采用病毒核酸提取试剂盒分离RNA。4)取5ul的分离的RNA，加入10pmol引物①，引物②、引物③、引物④、引物⑤和引物⑥分别加入2pmol，然后加入混合试剂，采用一步法进行RT-PCR扩增。5)将PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，用溴化乙锭染色，以凝胶成像确定已扩增的目的条带根据扩增的片断大小来判断轮状病毒的G基因型，提供预防治疗和研究的依据。

2.按照权利要求1所述通过VP7基因快速检测A组轮状病毒G基因型的新方法，其特征在于：设计了能特异性扩增不同基因型的六条核苷酸序列1)本发明的优点在于设计引物的特异性序列良好。本设计对轮状病毒VP7基因序列进行了分析比对，总结出不同基因型的特征性序列，这些序列的特点是在一种基因型中的序列保守，而在其他G基因型中极少分布，这些序列作为特异性扩增不同G基因型轮状病毒引物的候选位置。2)本发明的优点是不同G基因型轮状病毒扩增的VP7序列片段大小不同，差异明显，可以通过一次琼脂糖电泳区分并确定待测样品中含有的轮种病毒的G基因型。3)本发明的优点是尽可能的减少了引物数量，一条特异性引物就能扩增出一种特异性轮状病毒的G基因型。在PCR扩增过程中，随着引物的增加，引物之间的作用就越强，产生难以扩增出特异性的目的条带，容易扩增出非目的条带等特点。而本设计最大限度的减少了上述情况的发生。4)本发明的优点是检测快速，可以把待测样品放入含有多个基因型的特异性引物的体系中，一次PCR可以确定待测样品中轮状病毒的基因型。

3.按照权利要求1所述通过VP7基因快速检测A组轮状病毒G基因型的新方法，其特征在于：通过电泳检测，可判断样品中包含轮状病毒的G基因型：PCR产物大小为332bp时，表示该样本中含有G1型轮状病毒，PCR产物大小为600bp时，表示该样本中含有G2型轮状病毒，PCR产物大小为98bp时，表示该样本中含有G3型轮状病毒，PCR产物大小为471bp时，表示该样本中含有G4型轮状病毒，PCR产物大小为248bp时，表示该样本中含有G9型轮状病毒。

4.按照权利要求1所述通过VP7基因快速检测A组轮状病毒G基因型的新方法，其特征在于：检测结果准确可靠，提高检测样本的效率，降低检测成本，结果可以作为治疗的参照和进一步科学研究的参考。

5.按照权利要求1所述通过VP7基因快速检测A组轮状病毒G基因型的新方法，其特征在于：实验所选用的试剂与药剂均为市售产品。