[发明专利]通过VP7基因快速检测A组轮状病毒G基因型的新方法

说明书

技术领域

本发明涉及通过序列比对，在A组轮状病毒VP7基因上设计特异性引物，通过扩增不同片段和长度的基因序列，可以经济快速的判断出A组轮状病毒G基因型的新的检测方法。

背景技术

A组轮状病毒(以下简称轮状病毒)是引起婴幼儿腹泻的主要病原体之一，其主要感染小肠绒毛上皮细胞，从而影响肠道对盐类、木糖和水分的正常吸收，引起腹泻。轮状病毒每年主要在秋冬季流行，感染途径为粪一口途径，临床表现为低烧、呕吐和急性水样腹泻，病程一般为7天，可导致脱水、电解质紊乱和营养不良等，严重时可致死。

轮状病毒是呼肠孤病毒科的一个属，由三层蛋白衣壳组成，病毒基因组含11个分节段的双链RNA片段，分别编码6个结构蛋白和6个非结构蛋白。6个结构蛋白是架构整个病毒颗粒的病毒蛋白质(viral protein，VP)，分别被称为VP1、VP2、VP3、VP4、VP6与VP7；6个非结构蛋白(nonstructural protein，NSP)是指存在于感染病毒的细胞中，但不存在于成熟病毒颗粒中的蛋白，分别称为NSP1、NSP2、NSP3、NSP4、NSP5与NSP6。外壳结构蛋白VP7是一种具有中和抗原活性的糖蛋白(glycoprotein)，决定该病毒株的G基因型。

确定轮状病毒G基因型可以确定患者感染病毒的类型，并且可以确定该基因型病毒的传播范围，还可以对该病毒的进化过程提供研究数据。确定轮状病毒G基因型的经典方法主要根据VP7不同基因型序列特点扩增大小不同的特异性片段，通过扩增片段大小不同来判定不同的基因型。但随着时间的推移，轮状病毒VP7序列发生了很大的变异，原来经典的引物已经不能准确地判断轮状病毒G基因型。本次发明的新检测方法，可以准确快速地判断轮状病毒的不同G基因型。

发明内容

本发明的目的在于：提供通过VP7基因高效快速检测轮状病毒G基因型的新方法。对甄别轮状病毒不同G基因型有重要的科学价值，并能给患者的预防治疗提供准确的参考。

本发明的目的是这样实现的：通过VP7基因高效快速检测A组轮状病毒G基因型的新方法，包括1)根据Genebank序列上公开的上千条A组轮状病毒的VP7基因序列，进行分析比对，寻找在进化过程中VP7基因的相对保守序列，作为设计引物的参考。2)设计能特异性扩增不同基因型的六条核苷酸序列，作为检测不同G基因型的引物，引物分别为：①：5′-gctccttttaatgtatggtattg-3′；②：5′-taagaaacatttgcgataatgag-3′；③：5′-ggacaaacttttaccgtacagtc-3′；④5′-ttctagttaaggatttgagtacg-3′；⑤5′-tcagatatgtccaactcctcacc-3′；⑥5′-ttgaagtcaaaaacgtttcttgc-3′。引物长度均为23bp，将其结合到A组轮状病毒VP7基因的模板上，可特异性的扩增出大小不同的目的序列。3)在待测样品中加入200ul的PBS，然后进行3000转/分钟的转速离心30秒，吸取上清，采用病毒核酸提取试剂盒分离RNA。4)取2ul分离的RNA，加入10pmol引物1，引物23456分别加入2pmol，然后加入混合试剂，采用一步法进行RT-PCR扩增。5)将PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，用溴化乙锭染色，以凝胶成像确定已扩增的目的条带。根据扩增的片段大小来判断轮状病毒的G基因型，提供预防治疗和研究的依据。

上步中的引物①为通用的上游引物，可以和各种基因型的VP7基因结合。引物②是G1基因型(G1型)病毒的特异性下游引物，可以与引物①特异性扩增出轮状病毒G1型的VP7序列，序列大小为332bp，不能扩增出其他基因型的VP7序列。引物③是G2基因型(G2型)病毒的特异性引物，可以与引物①共同特异性扩增出轮状病毒G2型的VP7序列，序列大小为600bp，不能扩增出其他基因型的VP7序列。引物④为G3基因型(G3型)病毒的特异性引物，可以与引物①共同特异性扩增出轮状病毒G3型的VP7序列，序列大小为98bp，不能扩增出其他基因型的VP7序列。引物⑤为G4基因型(G4型)病毒的特异性引物，可以与引物①共同特异性扩增出轮状病毒G4型的VP7序列，序列大小为471bp，不能扩增出其他基因型的VP7序列。引物⑥为G9基因型(G9型)病毒的特异性引物，可以与引物①共同特异性扩增出轮状病毒G9型的VP7序列，序列大小为248bp，不能扩增出其他基因型的VP7序列。