[发明专利]HSP-GP96重组腺病毒载体及构建和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及HSP-GP96重组腺病毒的构建及应用，是利用分子克隆技术、包括PCR扩增基因、酶切插入连接等，获得能够转染多种白血病细胞的HSP-GP96重组腺病毒载体。继而采用蛋白纯化技术，从白血病细胞株K562提取了HSP-GP96白血病肽复合物，负载树突状细胞（DC）后，探讨了此复合物对白血病细胞K562，HL60和U937免疫杀伤和DC功能的影响，为进一步研制HSP肿瘤疫苗奠定了实验基础。

背景技术

由于肿瘤微小残留的存在，使肿瘤难以根治，所以国际上开始重视肿瘤的免疫治疗。但如何提高肿瘤生物治疗的特异性，如何诱导激活肿瘤特异性免疫功能，是迫切需要解决的问题。目前，只有少数肿瘤特异性抗原是已知的，如黑色素瘤。大部分肿瘤没有找到特异性抗原，而且肿瘤细胞具有高度异质性，若只针对单一抗原决定簇难以发挥最佳抗肿瘤作用。热休克蛋白(Heat shock protein，HSP) 是具有高度保守性的一类应激蛋白，从肿瘤组织中提取的HSP可以诱导机体产生抗肿瘤的MHCⅠ类限制性的细胞毒性T细胞免疫应答。HSP作为“分子伴侣”可携带肿瘤细胞的全部抗原，不用分离、纯化、鉴定所携带的肿瘤特异性抗原，用其制成的肿瘤疫苗具有多价性、特异性、便捷性，因此成为近来研究的热点。树突状细胞( dendritic cell，DC)在抗原递呈中具有重要作用，它是激活初始T细胞和维持细胞免疫最重要的抗原递呈细胞。目前对HSP-GP96肽与DC功能之间的相关研究不多，而白血病来源的HSP-GP96白血病肽复合物对DC的影响更是未见报道。我们采用蛋白纯化技术，从白血病细胞株K562，HL60和U937中提取了HSP-GP96白血病肽复合物，探讨了对白血病细胞免疫杀伤和DC功能的影响，为进一步研制HSP肿瘤疫苗奠定了实验基础。

本发明利用分子克隆技术,包括PCR扩增基因、酶切插入连接等。获得能够转染多种白血病细胞的HSP-GP96重组腺病毒载体。继而采用蛋白纯化技术，从白血病细胞株K562提取了HSP-GP96白血病肽复合物，探讨了此复合物对白血病细胞K562，HL60和U937免疫杀伤和DC功能的影响，为进一步研制HSP肿瘤疫苗奠定了实验基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种热休克蛋白- GP96（HSP-GP96）重组腺病毒载体，所述载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1。

本发明的另一个目的是提供上述载体的构建方法，通过以下步骤获得：

（1）引物、PCR模板及扩增基因序列

设计上游引物P1（SEQ ID NO:2）：5’- GCAGATCT atgaagttgatgtgg atg-3’； 下游引物P2（SEQ ID NO:3）：5’- CGAAGCTT ttacaattcatctttttC-3’，上游引物5’端包含BgLII酶切序列AGATCT，下游引物5’端包含Hind III酶切序列AAGCTT。扩增HSP-GP96基因序列（即为引物序列），取5ml 扩增产物，在1％琼脂糖凝胶中电泳证实有预期长度片段（2420bp 左右）；

（2）构建PSC- GP96穿梭载体

用BgLII和 Hind III双酶切PSC质粒和GP96基因PCR纯化物，经酶切连接后获得重组PSC- GP96穿梭载体，进行质粒的扩增和鉴定；

A．用BgLII和 Hind III双酶切PSC质粒和HSP-GP96基因PCR纯化物，经酶切连接后获得重组PSC- GP96穿梭载体；

B．制备DH                                                感受态细菌，取10 ml连接产物及1ml对照质粒加入100 ml DH5a感受态细胞，购于上海希匹吉生物技术有限公司，经PSC- GP96重组质粒及对照质粒PSC-LacZ的转化，然后进行阳性克隆的筛选和重组质粒酶切法鉴定，有2420bp左右插入片段释放出者视为阳性重组体；

(3) 腺病毒载体HSP-GP96与腺病毒载体LacZ的构建

A．PmeI酶切使PSC- GP96和PSC-LacZ线性化，各取3 ml1 0.75％琼脂糖凝胶电泳，确证PSC- GP96及PSC-LacZ已完全线性化，余酶切产物用StrataPrep? PCR purification kit纯化，最后各以20 ml水洗脱DNA，再行电转化；

B．阳性重组腺病毒载体质粒的鉴定，Ad-GP96重组子经卡那霉素抗性、