[发明专利]一种快速检测耐多药结核病的方法

权利要求书

1.一种快速检测耐多药结核病的方法，包括如下步骤：

（1）痰标本的前处理

采用碱处理—直接法；

（2）DNA提取；

（3）多重PCR及产物标记

在单一PCR反应试管里同时加入多对引物，在同一时间内扩增出多个产物的PCR；扩增rpoB基因的上下游引物为5’- CCAGGACGTGGAGGCGATCAC -3’, 5’- CTAACCACGCCGTCGACCACC -3’;扩增katG基因的上下游引物为：5’- TATGGGCCTGATCTACGT -3’, 5’- CGGTGCCCTGCGCCATCGGT -3’； 引物合成时在5’端进行生物素化；反应体系：5×PCR缓冲液，5μl；25mM MgCl，2μl；10mM dNTPs，0.5μl；25uM Biotin-KatG-F及Biotin-RpoB-F，各0.5μl；25uM Biotin-KatG-R及Biotin-RpoB-R，各0.5μl；Go-Taq DNA聚合酶，0.25μl；2.5ng/μL TB DNA模板，1μl；ddH2O，14.25μl；扩增程序：94℃5 min； 94℃1 min，60℃1 min，72℃1 min，共35个循环；72℃10 min；

（4）制备载有常见耐药菌株特异性核酸探针的低密度核苷酸薄膜

筛选出15个特异的针对rpoB基因、katG基因的野型及突变型的寡核苷酸探针，这种探针在5’末端含有一个氨基；一个人类基因组探针β-globin，一个生物素探针Biotin； 除外生物素探针外的16种探针序列为：WT513，5’-TC CAT GAA TTG GCT CAG CT-3’； Q513E，5’-TC CAT GAA TTC GCT CAG CT-3’； WT516，5’-AA TTC ATG GTC CAG AAC AA-3’； D516V，5’-AA TTC ATG GAC CAG AAC AA-3’； WT526，5’-GGG TTG ACC CAC AAG CGC CGA-3’；H526Y，5’-GGG TTG ACC TAC AAG CGC CGA-3’； H526D，5’-GGG TTG ACC GAC AAG CGC CGA-3’； WT531，5’-CGC CGA CTG TCG GCG CTG GGG-3’； S531L，5’-CGC CGA CTG TTG GCG CTG GGG-3’； S531W，5’-CGC CGA CTG TGG GCG CTG GGG-3’； WT315，5’-TC GAT GCC GCT GGT GAT CG-3’； S315T①，5’-TC GAT GCC GGT GGT GAT CG-3；S315T②，5’-TC GAT GCC TGT GGT GAT CG-3’； FWT505，5’-GT GCC GAA GAA CTC CTT GA-3’； NWT518，5’-AG CGG GTT GTT CTG GTC CA-3’； β-Globin，5’-AC CAC CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC-3’；

膜的微阵序列制备过程如下：裁剪出0.5cm×0.5cm大小的不带电荷的尼龙膜，用铅笔按表1进行标记；将标记好的尼龙膜浸入6×SSC中10分钟，备用；将合成的探针稀释为2.5-5.0μM,按表1用加样器进行点样，每个探针上样量为0.5-1.5μl；小心取下膜，置于TE缓冲液饱和的滤纸上，DNA面向上，10cm紫外灯下固定3-7min；立即用于杂交或在蒸馏水中浸洗，晾干后室温保存备用；

（5）核酸薄膜导流杂交

将标记的PCR产物与构建的载有常见耐药菌株特异性核酸探针的低密度薄膜进行分子杂交来检测结核分枝杆菌及耐药菌株MDR-TB；

（6）结果分析：用计算机采集薄膜上的图像以jpg格式保存，用ImageJ软件打开图像，将图像放大至400%后进行反色处理；测量图中如表1所示的30个点的密度，所得数据另存为.xls格式；计算所有n/a点的平均密度作为背景密度，B1的密度为阳性密度，按照公式0.12×（阳性密度-背景密度）+背景密度计算密度临界值；低于该临界值的密度判断为杂交阴性，高于该临界值的密度判断为杂交阳性。