[发明专利]一种快速检测耐多药结核病的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体来说涉及一种检测耐药结核菌株的方法。

背景技术

结核病（Tuberculosis, TB）是严重危害人类健康的传染病，已成为全球重大公共卫生问题和社会问题。迄今为止，全世界已有三分之一的人口感染结核分枝杆菌（Mycobacterium Tuberculosis，M.tb），仅2007年就有927万新发病例。全球每年新增耐多药结核病（Multi-drug Resistant Tuberculosis, MDR-TB） 患者超过50万人，但被检测出来的仅有不到5%，获得规范治疗的不到3%。此外，MDR-TB在治疗过程中也可能衍生成更难治疗的广泛耐药结核病（Extremely Drug Resistant Tuberculosis, XDR-TB）。MDR-TB和XDR-TB的出现与传播，使TB治疗难度加大，疫情加重，已成为全球TB控制工作中最为棘手的难题之一。

对MDR-TB的早发现、早诊断、早治疗能够提高患者治愈率，减少传染源，较好地控制结核分枝杆菌的传播与扩散，从而降低结核病对社会及国家产生的危害。 MDR-TB是指结核病患者感染的结核分枝杆菌体外被证实至少对异烟肼、利福平同时耐药，因此，检测结核分枝杆菌对异烟肼和利福平的耐药性对MDR-TB的诊断尤为重要，常用的方法有：1）传统培养法：操作繁琐且耗时长，从临床标本分离出结核分枝杆菌的时间通常≥6周，而要获得菌型鉴别和药敏结果则须再耗时4周，因此不利于MDR-TB的早发现及早诊断；2）自动化快速培养法：快速（1～2周）、可靠、安全，但是需要昂贵的仪器设备；3）聚合酶链式反应-单链构想多态性分析法（PCR-SSCP法）：其影响因素较多（DNA片段长度、凝胶浓度等），可重复性较差，且不能确定突变的位置及形式，在临床工作中也未得到广泛应用；4）RT-PCR法：检测位点单一，对检测条件要求高，限制其推广；5）DNA测序法：是目前判断基因突变及突变类型的金标准，结果可靠，可重复性好，操作快速简洁，可作为判断M.tb耐药基因突变型的方法之一供临床使用，但是该方法需要DNA序列测定仪，使得很多医院无法把该方法作为临床鉴定M.tb是否耐药的常规检查手段，且DNA序列分析图谱结果不够直观，需要专业人员对图谱分析后才能获得结果，耗费人力物力；6）寡核苷酸探针杂交法：是检测耐药基因突变的一种快速简洁的方法，但结果存在一定得假阴性率和假阳性率，且试剂价格相对昂贵，目前已有该方法检测M.tb耐药性的研究，但尚未得到临床推广；7）基因芯片法：虽然具有时限短、所需样本少、热循环和冷却效率高等优点，但因分析软件要求高，芯片的制作成本高等缺点极大地限制其应用；8）基于PCR的斑点杂交方法：已报道用来检测耐异烟肼、利福平、链霉素、和乙胺丁醇结核菌6个基因中的8个密码子，结果表明基于PCR的斑点杂交方法可以有效的检测耐药菌的突变，并且成本很低，但敏感性较低。

总之，以杂交技术为基础的检测方法较其他方法更有应用前景，但传统的或逆向的杂交技术退火效率较低，造成的原因有：（1）大量的杂交液需要覆盖于一个完整的膜上，因此，结合到目标DNA的探针浓度很低。由于杂交过程是各个分子相互碰撞的过程，这样的稀释将极大的影响探针在膜上结合到靶片段的效率。（2）在孵育期间，溶液中的探针没有接触到膜会增加其他游离的片段自身打折形成DNA互补链，因此，有效浓度的进一步减小和杂交时间延长导致了杂交DNA的减少，这使得杂交率下降。（3）在杂交过程中，容易结合的往往是那些固定在膜表面的片段，并且，实际上仅有很小的一部分靶DNA的片段是朝向外部的，由于膜上有孔，孔的直径大小一般是0.1-0.45微米，因此在固定过程中许多的DNA片段被固定在膜的孔里面。由于探针进入膜孔的弥散能力降低，因此靶DNA片段退火效率进一步降低，即使延长孵育的时间，上述这些因素仍导致其敏感性降低。除此之外，此类方法通常需要在玻璃管或塑料容器中反应，并且需要将其放在水浴或杂交箱内使其保持适宜的温度，往往需要数小时到数天的时间来完成杂交过程。

导流杂交技术是一种低密度微阵序列的发展，具有快速、价廉及操作简便等特点。导流杂交技术的主要原理是主动地将目标分子穿过薄膜载体上的小孔，加速两条互补链形成双链分子，从而提高杂交效率，将杂交时间从数小时缩短为数分钟，比传统的杂交方法速度提高了数百倍。互补的核酸分子产生杂交复合物的同时，游离的DNA分子则穿过薄膜后被清除，增加了杂交的敏感性和特异性。该技术既省时又节约反应物，在成本上远低于基因芯片，在操作上远优于传统杂交法，具有在临床上广泛推广与应用的前景。