[发明专利]一种枯草芽孢杆菌培养制剂生产方法及其开放式发酵方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌培养制剂生产方法及其开放式发酵方法。

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种严格好氧的革兰氏阳性菌，生命力极强，代谢旺盛，枯草芽孢杆菌在成熟期以孢子状态存在，具有极强的抗逆能力，是我国农业部列为安全使用的两种芽孢杆菌之一。

枯草芽孢杆菌具有促进动物营养的消化吸收；颉颃致病微生物，调节消化道健康；刺激动物免疫器官生长发育，提高机体免疫力等作用，所以，该菌在动物饲养和饲料工业应用广泛。除上述作用外，枯草芽孢杆菌还能通过代谢产生性能良好的微生物絮凝剂；以细胞壁吸附、富集水中的重金属离子；消耗水中氨氮，亚硝酸盐和硫化物，减轻水体富营养程度；以及分解水中的大分子有机质为光合细菌、藻类以及其他浮游生物提供营养。因此，该菌用于水产养殖时，还表现出对水质的净化作用。此外，枯草芽孢杆菌还是生物发酵床技术的主要作用菌株。因此，由枯草芽孢杆菌为主制成的微生态制剂，在畜牧业和水产养殖业中有广泛的应用发展前景。

目前，枯草芽孢杆菌的工业化生产常用液体发酵法。因为该菌为严格好氧菌，在液体缺氧环境下，很短时间内就会全部死亡，所以为方便运输使用，必须将该菌培养至抗逆性强的孢子状态，菌体与辅料混合干燥后制成微生态制剂产品。这一过程中微生态制剂产品的活菌含量大幅降低，提高了单位菌数的生产成本和销售价格；同时，枯草芽孢杆菌的孢子需要萌发后才能发挥生理作用，使用效果也不如活菌制剂。而实际上，无论饲料生产、水产养殖还是发酵垫料用户，在使用枯草芽孢杆菌时，希望使用活菌数高的新鲜菌剂，单位活菌数的价格越低越好。这一需求的最佳解决方案就是直接发酵培养，经过12-24小时培养，接种的枯草芽孢杆菌数量可提高数万至数亿倍。但枯草芽孢杆菌的液体发酵过程需要灭菌、接种和通气密闭发酵过程，枯草芽孢杆菌制剂的用户通常都不具备上述仪器和生产能力。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌培养制剂生产方法及其开放式发酵方法。本发明根据菌株的特性，将枯草芽孢杆菌菌种与培养基成分混合制成枯草芽孢杆菌培养制剂；然后将采用开放式液体培养方法进行小规模枯草芽孢杆菌的发酵培养，无需灭菌、接种和密闭培养条件，不仅方便枯草芽孢杆菌制剂用户的使用，更能大幅降低单位活菌数的生产成本，促进我国枯草芽孢杆菌微生态制剂在饲料和水产行业的使用，加速我国发酵床养殖技术的推广。该方法操作方便、无需严格的生产环境和昂贵的发酵设备，顺应枯草芽孢杆菌制剂的市场需求，具有广阔的发展前景。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案：一种枯草芽孢杆菌培养制剂生产方法，其特征是，包括下述步骤：

a枯草芽孢杆菌种子培养基的制备：以三角瓶盛装不高于总容量20％的适于细菌生长的培养基(如LB培养基：酵母粉5g，蛋白胨粉10g，氯化钠10g，加水定容至1000ml，以NaOH溶液调节至pH7.2)，121℃高压灭菌30分钟，冷却至室温；

b枯草芽孢杆菌种子培养基的发酵：将斜面保存的枯草芽孢杆菌菌种，接种至所述步骤a制备的枯草芽孢杆菌种子培养基中，37℃150rpm摇床振荡培养8-12小时，制成大罐发酵菌种；

c枯草芽孢杆菌液体发酵培养基的制备：发酵罐空消后，加入不高于总容积70％的枯草芽孢杆菌液体发酵培养基(一切适用于枯草芽孢杆菌生长的培养基，如LB培养基或以葡萄糖、玉米粉、豆粕粉和无机盐类为主要成分的培养基)，121℃实消灭菌30min以上，冷却至室温；

d枯草芽孢杆菌菌种的液体发酵：将步骤b中发酵完成的大罐发酵菌种接种至步骤c中制备的枯草芽孢杆菌液体发酵培养基中，接种量为枯草芽孢杆菌液体发酵培养基体积的0.05％-0.15％；发酵罐中37℃发酵24小时，发酵过程中保持通气比≥2，搅拌转数为150rpm，溶氧相对值不低于20，以NaOH溶液调节培养基至pH7.0-8.0，罐压在0.04-0.06Mpa；发酵完成后的枯草芽孢杆菌发酵液即为制备好的枯草芽孢杆菌制剂中的枯草芽孢杆菌菌种；液体培养物应尽快使用，短暂储存时必须保持鼓风通气状态，以降低菌体死亡比例；

e枯草芽孢杆菌菌种干粉的生产：为加工存储方便，也可将步骤d中发酵完成的枯草芽孢杆菌发酵液加入麦芽糊精或其他辅料以喷雾干燥的方法制成菌种干粉；