[发明专利]家蚕中部丝腺细胞合成分泌溶菌酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及利用转基因技术构建一种家蚕中部丝腺细胞合成分泌溶菌酶的方法。

背景技术

溶菌酶(Lysozyme)又称为胞壁质酶，分子由129个氨基酸组成，分子量约1 5 KDa，等电点约10.8。溶菌酶广泛存在于家禽和鸟类的蛋清中，存在于哺乳动物的眼泪、唾液、心、肺、肝、肾等液体及器官中，存在于大麦、芜青、无花果等植物中。其中以蛋清中的含量最高，约含0．3％，而人乳、眼泪、唾液中的活性最高，高于蛋清中的酶活性3倍。

溶菌酶是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，它破坏微生物细胞壁，引起细菌裂解，具有防腐和杀菌作用。而人和动物细胞无细胞壁结构，故溶菌酶对人和动物细胞无毒性作用，被广泛用于医疗、食品、畜牧和生物工程等领域。如医学上利用溶菌酶抗炎、消肿，增强免疫力。食品上利用溶菌酶作为保健食品添加剂，用于水产类熟制品、肉类制品的防腐和保鲜。在畜牧上用作饲料防腐剂和杀菌剂，用于家畜防治胃肠炎、消化不良等疾病。科学研究中，利用溶菌酶分解细胞壁后制备原生质体，用于微生物育种，用于细胞融合操作。

溶菌酶价格很高，平均每公斤约2万元。目前溶菌酶的生产主要是从生物组织中提取，提取的方法主要有直接结晶法、离子交换层析法、亲和层析法、超滤法、膜色谱技术(亲和膜色谱， 离子交换膜色谱) 法、反胶团苹取法、扩张床吸附法等。生产工艺复杂，成本高，效益低。随着生物技术的发展，利用基因工程技术生产溶菌酶是高效率、低成本的生产方法。

转基因家蚕中部丝腺生物反应器是在家蚕中部丝腺中表达外源基因的转基因动物表达系统。家蚕生长周期短，50天左右可完成一个世代，每个雌蛾可产卵约400粒；家蚕经过长达四千多年的人工驯养、选育，性情温顺，已完成丧失飞翔逃逸能力，而在丝蛋白合成、分泌方面具有非常强的能力；合成的蛋白可以随蚕丝蛋白一起分泌到体外，蚕丝蛋白主要由3种丝素蛋白和3种丝胶蛋白构成，成分简单。所以，转基因家蚕丝腺生物反应器构建容易，运行安全，表达外源蛋白效率高，外源蛋白多具有生物活性，蛋白纯化方便，只需要通过饲养转基因家蚕，就可以非常方便地维持表达系统的延续，是一种非常有价值的表达系统,具有广阔的实用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种家蚕中部丝腺细胞合成分泌溶菌酶的方法，利用转基因家蚕技术将溶菌酶基因导入家蚕基因组内，并在家蚕中部丝腺细胞中特异表达，开发出合成分泌溶菌酶的家蚕。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案的步骤如下：

（1）采用分子生物学技术构建家蚕合成分泌溶菌酶的载体pBSer1hLYZ-A3EGFP质粒。

（2）采用显微注射转基因家蚕方法将pBSer1hLYZ-A3EGFP质粒及能够提供转座酶trans的辅助质粒导入家蚕受精卵内，蚕卵孵化后饲养至成虫，自交续代为G1代，在G1代转基因家蚕的小蚕期，通过荧光体视显微镜观察选择表达EGFP标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫与丝胶蚕杂交续代为G2代，G2代以后再与丝胶蚕回交3-5代，以表达EGFP标志基因及丝胶蚕性状为每代的留种筛选标志。

（3）与丝胶蚕多次回交后的蚕，再采用自交的方法使溶菌酶基因纯合，采用转基因昆虫荧光基因表达相对量无损伤测定方法选择溶菌酶基因纯合的转基因家蚕，育成中部丝腺细胞能够合成分泌溶菌酶、基因纯合的转基因家蚕新品种。

所述的pBSer1hLYZ-A3EGFP质粒是以piggyBac转座质粒为基础，质粒带有Amp抗性基因以用于质粒的扩增和筛选，包含 piggyBac转座子的2个转座臂PBL和PBR，包含 2个功能表达框，一个是A3启动子启动的绿色荧光蛋白基因表达框A3 Promoter+EGFP+SV40，以用作转基因阳性家蚕的筛选标志，另一个是家蚕丝胶蛋白1启动子、带有便于提纯外源蛋白的His接头以及溶菌酶基因的表达框Ser1 Promoter +His+hLYZ+SV40，以表达溶菌酶，辅助质粒包含Amp抗性基因、piggyBac转座子的1个转座臂PBR、A3启动子启动的转座酶trans基因表达框A3 Promoter+ trans，以提供转座酶。

所述的以丝胶蚕性状为每代的留种筛选标志，其筛选的时期是蚕茧时期。

本发明具有的有益效果是：