[发明专利]一种琼脂糖凝胶的N-羟基丁二酰亚胺修饰方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种琼脂糖凝胶的N-羟基丁二酰亚胺修饰方法，属于层析分离中基质材料的修饰方法。

背景技术

层析技术是一种最有效、最普遍采用的生物分离技术和方法之一，层析技术的关键就是层析介质。琼脂糖凝胶具有良好的亲水性、化学可修饰性而作为层析介质的基质材料应用于各种生物大分子的分离纯化；其表面必须进行修饰，通过对其表面羟基的活化并偶联配基，进而衍生出各种层析介质。常见的羟基活化方法有溴化氰(CNBr)、环氧氯丙烷、高碘酸钠(NaIO₄)、二乙烯基亚砜，1，4-丁二醇二缩水甘油醚(BDGE)等。

烯丙基缩水甘油醚的一端环氧基活性较高，易开环与琼脂糖基质上的羟基反应，而另一端双键则相对惰性，交联或水解等副反应受到限制。与环氧氯丙烷、羰基二咪唑等常规的活化方法比较，烯丙基缩水甘油醚活化法具有活性高、副反应少的优点；相对于溴化氰法其活化过程也较安全。这种高效安全的活化方法为琼脂糖凝胶色谱介质的高密度配基偶联提供了可能。

末端含有N-羟基丁二酰亚胺基团(NHS)的琼脂糖凝胶可以共价结合含有伯胺基团的配基，对于制备免疫亲和介质来说经常是首选。相对于其他活化基团，末端含有NHS基团的琼脂糖与配基偶联时速度快、效率高，在介质的储存和层析过程中很少会发生配基泄露。并且，使用NHS-琼脂糖凝胶可以形成酰胺键，在pH为13的条件下仍能很稳定，适用于在纯化过程中需要较高pH条件的操作。

因此，本发明采用烯丙基缩水甘油醚对国产交联琼脂糖凝胶进行活化，加成巯基乙酸后，偶联N-羟基丁二酰亚胺，得到一种连接臂长度为10个原子、具有对氨基高度特异性的琼脂糖凝胶。通过控制琼脂糖凝胶活化双键的量，可使N-羟基丁二酰亚胺的修饰密度处在一个较宽的范围(20-150μmol/mL)，这将有效减少介质上杂基团的引入并有利于配基密度的设计。上述活化过程对介质的性能没有明显影响。活化介质在30min内即可完成对L-苯丙氨酸的偶联，效率在90％以上，且配基在贮藏过程中稳定性好、几乎无泄露。

发明内容

本发明的目的是提供一种琼脂糖凝胶的N-羟基丁二酰亚胺修饰方法。

所述的琼脂糖凝胶的N-羟基丁二酰亚胺修饰方法的步骤是：

1)烯丙基缩水甘油醚活化

将10mL琼脂糖凝胶水洗抽干，于砂芯漏斗中依次用5倍体积30％、70％丙酮洗涤，最后用5倍体积的100％二氧六环洗涤5次、抽干，转移到100mL具塞三角瓶中，加入10mL二氧六环、0.05-2mL烯丙基缩水甘油醚和50-300μL的三氟化硼乙醚，35℃下140rpm水浴摇床中反应45min，反应后的基质依次用5倍体积30％、70％丙酮洗涤，最后用大量去离子水洗涤干净；

2)双键加成巯基乙酸

取10mL活化基质，加入1.20mL巯基乙酸、10mL去离子水、0.25g过硫酸铵，60℃下反应8h；

3)N-羟基丁二酰亚胺基团的偶联

取10mL巯基乙酸羧化后的琼脂糖凝胶，分别用30％、70％和100％的丙酮溶液清洗，再用100％二氧六环清洗5次；将二氧六环替换后的琼脂糖凝胶转移到100mL带塞三角瓶中，加入10mL二氧六环、0.2-1gN-羟基丁二酰亚胺、0.2-1gN，N，-二环己基碳二亚胺，25℃振荡8-12h；最后用大量二氧六环、甲醇、丙酮清洗介质，于异丙醇溶液中避光贮存备用。

本发明采用烯丙基缩水甘油醚对交联琼脂糖凝胶进行活化，加成巯基乙酸后，偶联N-羟基丁二酰亚胺。本发明的优点在于：烯丙基缩水甘油醚的活化效率高，活化密度范围广；琼脂糖末端的N-羟基丁二酰亚胺对氨基特异性高，偶联配基后稳定性好；制备工艺简单，易于控制和放大；成本低廉，环境污染小。

附图说明

图1是本发明的工艺流程。

图2是本发明修饰后琼脂糖凝胶对L-苯丙氨酸的偶联性能。实验条件：25℃，150μmol双键/mL-湿胶。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的描述：

1、N-羟基丁二酰亚胺修饰

实施例1