[发明专利]一种LMP-1重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种LMP-1重组腺相关病毒载体，是将腺相关病毒载体中的腺相关病毒结构基因替换为EB病毒的LMP-1基因或其突变型基因得到的重组腺相关病毒载体。

2.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于：将所述重组腺相关病毒载体中的p5启动子替换为巨噬细胞病毒启动子、beta肌动蛋白启动子和SV40病毒启动子中的一个或几个启动子。

3.一种构建权利要求1所述重组腺相关病毒载体的方法，是先将腺相关病毒载体中的腺相关病毒结构基因剔除，再用所述肿瘤抗原LMP-1基因或其突变型基因取代该剔除基因，得到重组腺相关病毒载体。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述方法还包括将所述重组腺相关病毒载体中的p5启动子替换为巨噬细胞病毒启动子、beta肌动蛋白启动子和SV40病毒启动子中的一个或几个启动子的步骤。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

A.pBR-AAV2质粒的改建：先用限制性内切酶Bst98 I和Hpa I将pBR-AAV2质粒中的腺相关病毒AAV基因组的结构基因Rep和Lip/Cap基因完全切除，然后将含有限制性内切酶EcoR I和EcoR V酶切位点的核苷酸序列CGAATTCATGCGATATCGTT插入质粒中，保留两端完整的TR序列或将AAV基因组的两端TR的第75位核苷酸序列处均插入由9个核苷酸组成的片段CTGCGCTGG；

B.采用基因扩增技术扩增CMV启动子和SV40早期启动子；

C.PCR扩增beta肌动蛋白启动子、全长LMP-1cDNA和部分LMP-1cDNA片段；

D.采用DNA连接技术，将上述扩增的CMV启动子、SV40早期启动子、beta肌动蛋白启动子、全长LMP-1cDNA或部分LMP-1cDNA片段依次插入步骤A经改建的pBR-AAV2载体中，为插入启动子，首先进行酶切反应，然后进行连接反应，得到携带有CMV启动子、SV40早期启动子、beta肌动蛋白启动子和全长LMP-1cDNA的LMP-1重组腺相关病毒载体(命名为rAAV/LMP-1)，或携带有CMV启动子、SV40早期启动子、beta肌动蛋白启动子和LMP-1 cDNA片段的突变型LMP-1重组腺相关病毒载体(命名为rAAV/m LMP-1)。

6.与权利要求1或2所述或权利要求3或4或5所述方法制备得到的LMP-1重组腺相关病毒载体相关的产品，包括LMP-1重组腺相关病毒载体质粒、LMP-1重组腺相关病毒或被LMP-1重组腺相关病毒载体感染或转染的细胞系。

7.权利要求6所述LMP-1重组腺相关病毒载体相关的产品的制备方法，分别为：

重组腺相关病毒载体质粒的制备：在权利要求5所述方法A-D步骤后增加步骤E：将连接后的DNA-rAAV/LMP-1或rAAV/mLMP-1分别导入基因工程大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，用含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板进行抗性筛选，挑取白色单菌落，提取质粒并纯化，得到rAAV/LMP-1质粒和rAAV/mLMP-1质粒；

LMP-1重组腺相关病毒的制备：以所述LMP-1重组腺相关病毒载体质粒和pHelper质粒共转染AAV-HEK293细胞(宿主细胞)得到LMP-1重组rAAV病毒或突变型LMP-1重组rAAV病毒，分别命名为rAAV/LMP-1病毒和rAAV/mLMP-1病毒；

LMP-1重组腺相关病毒载体感染或转染的细胞系的制备：用所述LMP-1重组腺相关病毒分别或依次感染或转染单核细胞、树突状细胞(DC)和T淋巴细胞(CTL)得到，所述细胞系包括单核细胞-树突状细胞系和T淋巴细胞系。

8.权利要求1或2所述的LMP-1重组腺相关病毒载体在制备抗鼻咽癌药物中的应用。

9.权利要求6所述的产品或权利要求7方法制备得到的rAAV/LMP-1或rAAV/mLMP-1质粒、rAAV/LMP-1或rAAV/mLMP-1病毒、被LMP-1重组腺相关病毒分别或依次感染或转染得到的单核细胞或DC或CTL在制备抗鼻咽癌药物中的应用。

10.一种体外杀灭肿瘤的方法，包括以下步骤：

1)将肿瘤所在体系中自然产生的单核细胞-树突状细胞或T淋巴细胞被权利要求1或2所述或权利要求3或4或5所述方法制备得到的携带野生型肿瘤抗原基因的重组腺相关病毒载体和/或携带突变型肿瘤抗原基因的LMP-1重组腺相关病毒载体感染或转染，或被权利要求6所述或权利要求7方法制备得到的与LMP-1重组腺相关病毒载体相关的产品处理，各自得到处理后的细胞；

2)将步骤1)中处理后的单核细胞-树突状细胞加入肿瘤所在体系中杀灭肿瘤；或将未被处理的T淋巴细胞与所述处理后的单核细胞-树突状细胞混合培养形成抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞，再将该抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞加入肿瘤所在体系中杀灭肿瘤；或将被处理的T淋巴细胞和未被处理的单核细胞-树突状细胞加入肿瘤所在体系中杀灭肿瘤。